药物发现是药物研发的初始阶段,是人们寻找和认识物质药用价值的实践过程。药物发现包括药物分子的设计、合成、药物靶标的发现与确认、先导化合物的筛选和优化等过程。农药发现具有相似的过程,其中新型靶标的发现以及基于新型靶标的创新农药发现在现代农药发展过程中具有重要地位。D1蛋白是光合作用系统Ⅱ核心复合体的重要组成部分,由D1蛋白前体通过D1蛋白酶（carboxyterminal processing protease of D1 protein,CtpA）的酶切作用转化而来,在此过程中,D1蛋白酶主要剪切D1蛋白前体羧基端延伸肽段,将D1蛋白前体转化为成熟D1蛋白。由于当前广泛使用的除草剂作用靶标是D1蛋白,而D1蛋白酶在植物体内的含量只有D1蛋白的1%,因而D1蛋白酶被认为是一个新型高效的除草剂作用靶标。提取纯化D1蛋白酶,并建立基于D1蛋白酶靶标的新型抑制剂生物活性的筛选方法,对于发现D1蛋白酶抑制剂先导化合物及其结构优化具有重要意义。本论文工作主要包括三方面的研究内容:1)D1蛋白酶的提取纯化;2)D1蛋白酶比活力和米氏常数K_m的测定;3)基于D1蛋白酶靶标的抑制剂先导化合物生物活性研究。1).分离纯化D1蛋白酶以新鲜菠菜为原料,经过研磨、匀浆,缓冲液溶解等步骤提取叶绿体,采用超声波破碎和缓冲液溶解获得内囊体膜总蛋白,通过硫酸铵盐析沉淀得到粗蛋白酶。粗蛋白酶经过阴离子交换和凝胶过滤柱层析进行进一步提纯,获得纯度达到90%的D1蛋白酶。2).D1蛋白酶比活力和米氏常数K_m的测定以合成的D1蛋白前体羧基端24肽作为模拟底物,采用高效液相色谱分析D1蛋白酶催化模拟底物的水解反应,跟踪检测了D1蛋白酶分离提纯过程各步骤获得的D1蛋白比活力,最大比活力达到0.172 nmol·mg^-1·min^-1;测定了D1蛋白酶对模拟底物24肽的米氏常数K_m为19.6μM。3).基于D1蛋白酶靶标的抑制剂先导化合物生物活性研究。以菠菜D1蛋白前体的羧基端24肽为模拟底物,以高效液相色谱（HPLC）为分析手段,测定了部分D1蛋白酶抑制剂先导结构化合物的生物活性,建立了基于D1蛋白酶靶标的新型抑制剂先导化合物生物活性研究平台。采用的部分D1蛋白酶抑制剂先导结构化合物的分子结构如下所示:上图中的四个D1蛋白酶抑制剂先导化合物由本实验室通过同源模建、虚拟筛选以及化学合成得到。基于靶标酶的生物活性测试表明,这四个化合物a1、a2、b1、b2对D1蛋白酶催化活性具有明显的抑制作用。这些化合物对D1蛋白酶的抑制作用属于竞争性抑制,抑制常数分别为3.8,4.9,5.2,8.8μM。对照这些化合物的除草活性数据,可以得知,具有较低抑制常数的化合物如a1和a2,在100 ppm时,其对双子叶植物油菜生长的抑制率均达到100%。因此,本研究工作建立了一个以酶学反应和HPLC检测的D1蛋白酶靶标验证和D1蛋白酶抑制剂筛选的方法。