论文部分内容阅读
目的利用基因芯片技术筛选脊柱结核(spinal tuberculosis,STB)患者椎间盘病灶组织中差异表达的环状RNA(circular RNA,circ RNA),分析其在STB发病中可能的分子作用机制和在外周血中作为诊断标志物的价值。方法选取2019年9月至2021年12月就诊于宁夏医科大学总医院脊柱骨科确诊为STB并住院行手术治疗的患者35例作为实验组,同期选择年龄、病变节段相匹配的腰椎间盘退变住院行手术切除的患者35例作为对照组,每组各收集3例术中切除的间盘组织;收集实验组术前35例、随访至术后6个月(28例)及随访至术后1年(16例)的外周血标本,分别定义为A组、B组和C组;收集对照组术前的外周血标本35例。选择实验组和对照组各3份间盘组织RNA质量合格的标本,利用Arraystar Human circ RNAArray V2(8x15K,Arraystar)芯片检测实验组和对照组组织的circ RNA,筛选出STB和腰椎退变患者中差异表达的circ RNA;对差异表达的circ RNA分子的亲本基因进行基因本体(gene ontology,GO)生物学过程富集分析和京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,探究差异表达circ RNA的亲本基因的功能;用mi Randa和Target Scan软件预测差异circ RNA可能靶向作用的微小RNA(micro RNA,mi RNA),构建circ RNA-mi RNA调控网络;根据芯片测序结果,选择显著差异表达的hsa_circ_0001021、hsa_circ_0043898、hsa_circ_0093669在STB外周血中进行q RT-PCR验证,利用受试者工作特征曲线(receiver operator characteristic curve,ROC曲线)评估各指标单独及分别联合红细胞沉降率(erythrocyte sedimentation rate,ESR)和C反应蛋白(C-reactive protein,CRP)在STB中的诊断价值;培养单核细胞株THP-1及H37Ra,建立H37Ra在不同感染复数(multiplicity of infection,MOI;MOI=0、1、10、20、40、100)和在MOI=10时不同感染时间(T=0h、6h、12h、24h)感染巨噬细胞的感染模型,用q RT-PCR检测不同感染条件下巨噬细胞中hsa-circ-0001021、hsa-circ-0043898的表达水平,为进一步深入研究circ RNA在STB发病机制中可能发挥的作用提供基础。结果1.STB患者的间盘病灶组织中差异表达的circ RNA(差异倍数>2,P<0.05)共有1396种,其中有757种表达上调,639种表达下调;hsa_circ_0031968、hsa_circ_0001806、hsa_circ_0077607、hsa_circ_0071312、hsa_circ_0062683表达显著上调;hsa_circ_0004183、hsa_circ_0000367、hsa_circ_0000691、hsa_circ_0006220、hsa_circ_0043278表达显著下调;2.对筛选得到的circ RNA所对应的亲本基因进行GO分析发现其主要参与细胞蛋白分解代谢过程及GTP酶结合、染色质的共价修饰、组蛋白修饰、转录因子结合、转录辅助调节因子活化、蛋白激酶激活等过程;KEGG通路分析主要富集在内质网中的蛋白质加工、细胞凋亡、蛋白水解、c GMP-PKG信号通路、AMPK信号通路、EB病毒感染等信号通路;3.A组中hsa_circ_0001021、hsa_circ_0043898和hsa_circ_0093669表达较对照组均升高(P<0.05);B组和C组较A组表达下降(P<0.05);B组和C组之间无明显统计学差异(P>0.05);B组和C组较对照组无明显统计学差异(P>0.05);ROC曲线分析外周血中hsa_circ_0001021及联合ESR、CRP诊断STB的曲线下面积(area under the curve,AUC)是0.888、0.936和0.946,约登指数是0.604、0.800和0.789,敏感性是70.37%、100.00%和88.89%,特异性是90.00%、80.00%和90.00%;hsa_circ_0043898及联合ESR、CRP诊断STB的AUC是0.850、0.959和0.969,约登指数是0.624、0.781和0.884,敏感性是80.00%、96.00%和92.00%,特异性是82.14%、82.14%和96.43%;hsa_circ_0093669及联合ESR、CRP诊断STB的AUC是0.893、0.930和0.959,约登指数是0.693、0.807和0.829,敏感性是80.00%、95.00%和90.00%,特异性是89.29%、85.71%和98.26%;4.H37Ra不同感染条件下感染巨噬细胞与空白对照组比较,当H37Ra的感染复数MOI>1时,hsa-circ-0001021的相对表达量呈现逐渐升高趋势,在一定MOI范围内,MOI=100时表达量达最高(P<0.001);hsa-circ-0043898的相对表达量整体呈现升高趋势(P<0.001)。在MOI=10时不同感染时间条件下,随感染时间延长,hsa-circ-0001021的相对表达量呈现逐渐升高趋势,T=24h表达量最高(P<0.05),hsa-circ-0043898的相对表达量T=6h时变化不明显,随感染时间的延长,T=12h时表达量显著升高,T=24h最高(P<0.05)。结论1.STB患者椎间盘病灶组织中差异表达的circ RNA可能与STB的发病机制密切相关,有望在未来成为STB潜在临床诊断或治疗的靶点;2.Hsa_circ_0001021、hsa_circ_0043898和hsa_circ_0093669在STB外周血中可作为新型生物学诊断标志物,且具有一定的术后疗效评估价值,联合ESR和CRP可明显提高诊断价值;3.Hsa-circ-0001021和hsa-circ-0043898在H37Ra感染的巨噬细胞中呈现高表达,且随感染时间的延长表达量呈现上升趋势,可能在STB病免疫反应过程中发挥了重要作用。