人脐带间充质干细胞外泌体对ARPE-19有氧代谢影响的体外实验研究

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目的研究人脐带间充质干细胞分泌的外泌体(hucMSC‐Ex)对氯化钴诱导氧化损伤的人视网膜色素上皮细胞株(ARPE-19)有氧代谢功能的影响,以及探讨hucMSC‐Ex对ARPE-19细胞氧化损伤的保护作用机制。方法1、使用试剂盒法提取人脐带间充质干细胞外泌体;利用透射电镜对hucMSC‐Ex进行形态学鉴定;采用Western blot对hucMSC‐Ex的标志蛋白进行鉴定;2、采用CCk-8法建立CoCl2诱导的ARPE-19细胞氧化损伤模型;3、实验分组:1)正常对照组(正常培养的ARPE-19细胞);2)未干预组(CoCl2损伤细胞后不更换原培养基继续培养24h);3)不同浓度hucMSC‐Ex干预组(CoCl2损伤细胞后弃去原培养基,加入外泌体浓度分别为0ug/ml、25ug/ml、50ug/ml、100ug/ml的新培养基继续培养24h);使用JC-1法检测各组ARPE-19细胞的线粒体膜电位;使用分光光度法检测各组ARPE-19细胞有氧代谢酶(氧化呼吸链复合体Ⅰ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ)活性及ATP合成量。结果1、使用SBI ExoQuick-TC试剂盒法提取出人脐带间充质干细胞外泌体,透射电镜下观察到hucMSC‐Ex为圆形和椭圆形膜性小囊泡,直径约在40100nm之间;Western blot结果显示hucMSC‐Ex表达特异性标志蛋白CD63及CD9;2、CCk-8法检测细胞存活率结果显示:100μmol/L(93.38±4.28%)、400μmol/L(50.71±2.33%)和800μmol/L(25.06±3.75%)CoCl2浓度处理的ARPE-19细胞存活率与对照组(CoCl2 0μmol/L)有统计学差异,P<0.05;当CoCl2浓度为500μmol/L时,ARPE-19细胞存活率为50%,是最佳的氧化损伤浓度;3、1)呼吸链复合体Ⅰ酶活性(nmol/min/10^44 cell):100ug/ml外泌体组(0.066±0.00)>未干预组(0.052±0.052)>50ug/ml外泌体组(0.026±0.052)>25ug/ml外泌体组(0.018±0.052)=正常细胞组(0.018±0.052)>0ug/ml外泌体组(0.015±0.00);2)呼吸链复合体Ⅲ酶活性(nmol/min/10^44 cell):未干预组(0.025±0.00)与0ug/ml外泌体组(0.025±0.00)、25ug/ml外泌体组(0.015±0.035)、50ug/ml外泌体组(0.025±0.00)和100ug/ml外泌体组(0.025±0.00)之间无明显差异;且均低于正常细胞组(0.062±0.018);3)呼吸链复合体Ⅳ酶活性(nmol/min/10^44 cell):100ug/ml外泌体组(0.0089±0.00)=正常细胞组(0.0089±0.00)>50ug/ml外泌体组(0.0067±0.031)>未干预组(0.0044±0.00)=0ug/ml外泌体组(0.0044±0.00)=25ug/ml外泌体组(0.0044±0.00);4)呼吸链复合体Ⅴ酶活性(nmol/min/10^44 cell):100ug/ml外泌体组(0.078±0.00)>未干预组(0.0020±0.00)=25ug/ml外泌体组(0.0020±0.00)>50ug/ml外泌体组(0.017±0.0077)>0ug/ml外泌体组(0.0010±0.00)=正常细胞组(0.0010±0.00);5)ATP合成量(umol/10^44 cell*10):100ug/ml外泌体组(0.020±0.0016)>未干预组(0.018±0.0041)>50ug/ml外泌体组(0.013±0.0013)>25ug/ml外泌体组(0.0044±0.00032)>0ug/ml外泌体组(0.0036±0.00063)>正常细胞组(0.0020±0.00095);以上数据均有统计学意义(P<0.05)。结论1.hucMSC‐Ex对体外CoCl2诱导氧化损伤的ARPE-19细胞具有一定的保护作用。2.hucMSC‐Ex对氧化损伤ARPE-19细胞的保护作用机制可能是通过拯救其有氧代谢功能,恢复细胞ATP合成量,提高细胞修复损伤及处理缺氧环境的能力。3.hucMSC‐Ex可能对于治疗与RPE损伤相关的视网膜疾病有一定的临床应用前景。
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