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背景类风湿性关节炎(RA)是一种慢性的自身免疫性疾病,以关节滑膜炎症以及软骨和骨骼的破坏为主要的病理变化,该病是一种全身性疾病,在世界范围内广泛发病。目前对于RA的发病机制还不是很清楚,临床上也缺乏针对该病的有效的治疗方法,西医治疗中常使用激素类、非甾体类抗炎药类及免疫抑制类药物虽然可以缓解疾病发生发展,但副作用较大。天麻(Gastrodia elata,GE)属于兰科天麻属植物,是一种传统药材,在我国西南高原地区广泛存在,主要具有较好的抗氧化、抗炎症、抗肿瘤以及平喘等功效,在我国中医发展史中被广泛使用,目前已有研究表明,GE可有效缓解小鼠小胶质瘤细胞(BV-2)炎症反应,但GE在RA患者炎症反应过程中发挥的作用还未有报道。成纤维样滑膜细胞(FLS)主要位于关节滑膜上,FLS的增生可影响关节软骨和骨骼对营养物质的吸收,在RA的发生发展中起着十分重要的作用,因此,FLS也常被作为一种细胞模型用于RA的体外研究中。TNF-α是由单核巨噬细胞产生的炎性因子,在RA患者关节中分布广泛,它可以通过调控信号通路进而诱导其它炎性因子(如IL-6、IL-8等)的表达,促进机体的炎症反应,NF-κB作为重要的转录因子,可以调控多种炎性因子的表达,通过对NF-κB进行分析,可以对GE在RA炎症反应中致病机制进行深入研究。目的本研究拟通过构建鸡II型胶原诱导CIA小鼠模型,检测不同浓度天麻(GE)作用后小鼠关节肿胀和软骨损伤情况以及小鼠血清中抗体水平和相关炎症因子的表达水平,对GE在CIA小鼠模型体内的药学作用进行研究;通过构建体外类风湿性关节炎患者滑膜细胞(RA-FLS)模型,分析不同浓度GE对细胞活性、细胞增殖、TNF-α诱导的细胞炎症反应、细胞凋亡以及NF-κB转录活性的影响,探究GE对RA-FLS细胞炎症反应的影响;通过研究NF-κB抑制剂(PDTC)和天麻对NF-κB转录活性的影响,以及细胞中炎性因子的表达和细胞凋亡情况,旨在了解GE对RA-FLS细胞炎症反应的缓解机制,为RA的临床靶向治疗提供依据。方法(1)构建鸡II型胶原诱导CIA小鼠模型,从动物整体水平上对GE的药学机制进行研究。在21 d二免后对治疗组小鼠分别注射5μg/m L和10μg/m L的GE,每隔3 d观察不同浓度GE对CIA小鼠关节肿胀的影响,并采用Micro-CT放射成像技术对各组小鼠关节进行扫描,记录软骨损伤程度以及骨密度变化。在治疗结束后采用ELISA法对小鼠血清Ig G、血清及关节中IL-1β、IL-6、IL-8表达水平进行分析;设计并合成MMP-3、MMP-13特异性引物,采用q RT-PCR法对小鼠关节组织中MMP-3、MMP-13 m RNA表达水平进行分析。(2)构建体外类风湿性关节炎患者滑膜细胞(RA-FLS)模型,通过体外试验研究GE对TNF-α诱导的RA-FLS细胞炎性反应的影响。MTT法测定不同浓度GE(0~20μg/m L)对RA-FLS细胞活性的影响,以及治疗后不同时间各组细胞的增殖情况;在GE治疗后24 h,分别采用ELISA和q RT-PCR对各组细胞中TNF-α诱导的IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13表达水平进行分析;采用流式细胞术对TNF-α诱导的各组细胞凋亡情况进行分析;采用Westernblot对不同浓度GE作用的细胞中NF-κB相关的转录因子表达水平进行分析。(3)炎性因子的表达受信号通路的调控,为了解GE是否通过抑制NF-κB信号通路进而影响细胞的炎症反应,在本实验中我们引入NF-κB信号通路抑制剂作为阳性对照,对GE抗炎作用机制进行研究。将FLS细胞分为空白组、NC组、PDTC组、GE组、PDTC+GE组,在GE和PDTC作用后24h,采用Westernblot对TNF-α诱导的细胞中NF-κB相关的转录因子表达水平进行分析;采用q RT-PCR对各组细胞中IL-1β、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13表达水平进行分析;采用流式细胞术对TNF-α诱导的各组细胞凋亡情况进行分析。结果(1)小鼠关节肿胀结果显示,模型组小鼠在造模结束后关节肿胀情况逐渐加重,GE治疗可以明显缓解关节肿胀情况(P<0.05),其中高剂量组比低剂量组对肿胀缓解效果好;Micro-CT扫描结果显示,造模组小鼠关节均出现一定程度的侵蚀现象,且关节间隙明显缩小,骨密度降低,模型组小鼠关节受损最严重,GE治疗后可明显缓解关节受损现象,且骨密度较模型组相比有明显恢复(P<0.05),其中高剂量组对关节受损的治疗效果更好;ELISA法检测结果显示,造模后小鼠血清抗体Ig G2a、Ig G2b以及血清和关节中的细胞因子TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8水平均升高,GE治疗后可明显降低以上各指标的表达水平(P<0.05),且高剂量组与低剂量组相比降低更明显;q RT-PCR结果显示,造模后小鼠关节中MMP-3、MMP-13表达水平均升高,GE治疗后可明显降低MMP-3、MMP-13表达水平(P<0.05),且高剂量组与低剂量组相比降低更明显。(2)MTT法结果显示,GE治疗组RA-FLS细胞活性和细胞增殖明显受到抑制,GE浓度为1~10μg/m L时随着浓度的增加,细胞活性和增殖的抑制作用逐渐增强,之后抑制作用被减弱。ELISA结果显示,TNF-α诱导后,各组RA-FLS细胞中IL-1b,IL-6,IL-8表达水平显著升高(P<0.05),GE治疗后炎性因子的表达明显受到抑制(P<0.05),其中高剂量GE对细胞因子表达的抑制作用最明显;Westernblot和q RT-PCR结果显示,TNF-α诱导后,各组细胞中MMP-3、MMP-13蛋白和m RNA水平的表达均显著升高(P<0.05),GE治疗后MMP-3、MMP-13表达明显受到抑制(P<0.05),其中高剂量GE对MMP-3、MMP-13表达的抑制作用最明显;流式细胞术结果显示,TNF-α诱导后各组细胞凋亡率明显降低(P<0.05),GE治疗后细胞凋亡被诱导,高剂量GE对细胞凋亡的诱导作用最明显;Westernblot对NF-κB通路中相关蛋白测定结果显示,TNF-α诱导后细胞中p65磷酸化水平明显升高,NF-κB抑制蛋白IκBα表达水平明显降低,GE治疗可抑制p-p65表达同时激活IκBα的表达,其中高剂量GE对p-p65的抑制作用以及对IκBα的激活作用最显著。(3)Westernblot结果显示,NC组p65磷酸化水平明显升高,IκBα表达水平明显降低(P<0.05),PDTC组、GE组、PDTC+GE组p-p65表达被抑制,IκBα表达被诱导,其中GE组对p-p65的抑制作用以及对IκBα的诱导作用比PDTC组明显,PDTC+GE组作用最明显;q RT-PCR结果显示,NC组IL-1b、IL-6、IL-8、MMP-3、MMP-13 m RNA表达水平均明显升高(P<0.05),与NC组相比,PDTC组、GE组、PDTC+GE组各炎性因子表达水平均受到抑制(P<0.05),其中GE组对炎性因子表达的抑制作用比PDTC组明显,PDTC+GE组抑制作用最明显;流式细胞术结果显示,NC组细胞凋亡率明显降低(P<0.05);与NC组相比,PDTC组、GE组、PDTC+GE组细胞凋亡率均升高(P<0.05),其中GE组对细胞凋亡的诱导作用比PDTC组明显,PDTC+GE组诱导作用最明显。结论GE可以有效缓解关节受损及关节炎症反应,抑制RA-FLS细胞活性和增殖,诱导细胞凋亡,并通过抑制NF-κB信号通路抑制相关炎性因子的表达进而缓解RA患者关节炎症反应。