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背景与目的:雄激素性脱发、斑秃等各种原因引起的脱发不仅影响外观,对患者心理也有负面影响,严重影响患者生活质量。随着经济的发展和人民生活水平的不断提高,对各种脱发相关疾病的治疗期望值也越来越高。筛选有效促进毛发生长和再生的药物并用于临床值得深入研究。近来成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factors,FGFs）在器官发育、糖尿病、肿瘤发生与转移等生理病理过程中的重要作用逐渐受到重视。在毛发研究领域,尤以FGF9亚家族（FGF9、FGF16、FGF20）对毛发的发育、生物学行为的调控受到重视。我们前期工作中已经检测了多种生长因子对毛发生长调节作用,包括EGF、aFGF、bFGF、FGF10等,发现部分生长因子单独或协同促进毛发生长作用,尤其FGF20具有调节毛发生长/再生的潜在作用。但FGF20对毛发的具体调节作用及机制有待进一步研究。我们拟分别在毛囊器官离体培养模型、皮内注射FGF20动物模型、Patch Assay模型中检测FGF20对毛囊生长、周期转换和再生的作用,并探究Wnt信号通路在其中作用机制。材料与方法:1、研究对象:C57BL/6小鼠,裸鼠。2、FGF20对培养毛囊生长作用研究:构建小鼠触须毛囊器官培养模型。小鼠触须毛囊等分为4组,A组为空白对照组;B组加入10ng/ml FGF20;C组加入100ng/ml FGF20;D组加入1000ng/ml FGF20。（1）培养前和培养1周后在解剖显微镜下测量每根毛囊长度,观察FGF20对毛囊生长速度调节作用。（2）收集对照组和FGF20 100ng/ml组培养后第3天毛囊,制作石蜡切片,HE染色观察对照组和FGF20处理组培养后触须毛囊形态。（3）收集对照组和FGF20 100ng/ml组培养后第3天毛囊,制作石蜡切片,免疫荧光方法检测Ki67表达水平,检测毛囊基质细胞增殖能力变化。3、FGF20对小鼠毛囊周期转换调节作用研究:出生后60天大小雌性C57BL/6小鼠60只,随机等分为对照组和FGF20注射组2组,每组30只。对照组于后背皮内注射250μl DPBS溶液,每天1次,连续14天。FGF20注射组于后背皮内注射250μl FGF20溶液（含1μg FGF20）,每天1次,连续14天。（1）每天观察小鼠生长状态,计数进入生长期小鼠数目,并数码相机照相。（2）注射后第3天,收集对照组和FGF20处理组各5只小鼠后背皮肤,制备表皮和毛囊单个细胞悬液,流式细胞检测CD34+CD49f+毛囊干细胞,CD34-CD49f+Pcadhi毛囊前体细胞比例及增殖能力。（3）注射处理后第3天、第7天、第10天和第14天,对照组和FGF20处理组分别处死5只小鼠,并收集后背皮肤标本,处理后第10天两组各额外处死5只小鼠并收集后背皮肤标本。注射处理后第3天、第7天、第10天和第14天石蜡标本行HE染色,观察毛囊周期变化。（4）对照组和FGF20处理组各选取3个处理后第10天标本,提取总RNA进行小鼠Wnt信号通路PCR Array检测。（5）注射处理后第3天、第7天、第10天和第14天标本提取总RNA,qPCR检测PCR Array筛选出差异表达基因RNA表达水平变化（Wnt5a,Fzd4,Lrp5,β-catenin,Lef1,Tcf1）。（6）注射处理后第3天、第7天、第10天和第14天标本行免疫组化/免疫荧光染色检测PCR Array筛选出差异表达基因蛋白表达水平及表达位置变化（Wnt5a,Fzd4,Lrp5,β-catenin,Lef1,Tcf1）。（7）注射处理后第3天、第7天、第10天和第14天标本行Western Blot检测PCR Array筛选出差异表达基因蛋白表达水平变化（Wnt5a,Lef1,Tcf1）。4、FGF20对毛囊再生调节作用研究:构建Patch Assay模型:新生小鼠表皮细胞单细胞悬液和触须毛乳头培养细胞注射到裸鼠皮内。分为对照组（表皮细胞+普通毛乳头细胞混悬液）和FGF20组（表皮细胞+FGF20 100ng/ml培养组毛乳头细胞混悬液,注射时再额外加FGF20到混悬液中终浓度为100ng/ml）。（1）构建Patch Assay后第14天分别收集3只裸鼠背部每个注射部位标本。解剖显微镜下照相,计算两组所形成囊样结构体积大小,计数两组新生毛发数量。（2）石蜡标本HE染色,观察对照组和FGF20处理组的显微结构差异。结果:1、FGF20促进培养毛囊生长:（1）在一定范围内,随着FGF20浓度增大,培养触须毛囊生长速度增快,FGF20浓度100ng/ml组生长速度明显快于对照组。当FGF20浓度增大至1000ng/ml时毛囊生长速度比FGF20浓度100ng/ml组慢,过高FGF20浓度可能抑制毛囊生长。（2）HE染色未见对照组和FGF20浓度为100ng/ml组培养触须毛囊明显形态学差异。（3）Ki67免疫荧光染色可见在毛囊基质部位FGF20 100ng/ml处理组Ki67阳性细胞数量明显比对照组高,表明FGF20处理组触须毛囊增殖能力比对照组明显增强。2、FGF20促进小鼠毛囊由静止期向生长期的转换:（1）FGF20处理组从第6天开始即有小鼠进入生长期,比对照组明显提前,第8天时大部分FGF20处理组小鼠均进入生长期。截止处理第14天,FGF20处理组小鼠绝大部分均进入生长期,对照组仅40%进入生长期,且FGF20处理组小鼠背部进入生长期面积明显大于对照组。（2）HE染色显示处理后第3天,两组小鼠背部毛囊均处于静止期。处理后第7天,部分FGF20处理组小鼠背部毛囊已经进入生长期初期,而对照组仍处于静止期。处理后第10天,部分对照组小鼠背部毛囊刚开始进入生长期初期,而FGF20处理组基本均处于生长期中期。处理后第14天,部分对照组小鼠背部毛囊进入生长期初期和中期,而FGF20处理组基本均处于生长期后期。（3）流式细胞检测发现,FGF20处理组CD34+CD49f+毛囊干细胞比例明显高于对照组。且FGF20处理组毛囊干细胞增殖能力高于对照组。CD34-CD49f+Pcadhi毛囊前体细胞的比例和增殖能力,两组无明显差异。（4）PCR Array实验检测发现Wnt信号通路相关的84个基因中有27个基因表达水平差别2.5倍以上。尤其Wnt5a、Fzd4、Lrp5、Lef1、Tcf1在FGF20处理组表达水平上调。此外Wnt信号通路关键因子β-catenin表达水平也有较大差异（1.91倍）。（5）qPCR验证发现,第3天时FGF20处理组Wnt5a表达水平已较对照组明显增高,β-catenin和Lef1的表达水平也较对照组升高。处理后第7天和第10天,FGF20处理组Wnt5a、Lrp5、Fzd4、β-catenin、Lef1、Tcf1的RNA表达水平均高于对照组。处理后第14天,FGF20处理组Wnt5a、β-catenin、Lef1、Tcf1表达水平仍高于对照组。（6）免疫组织化学染色/免疫荧光染色检测显示,FGF20处理组Wnt5a在第3天即有高表达,第7天、10天、14天均明显高于对照组。Lrp5、Fzd4在对照组和FGF20处理组表达水平无明显差异。FGF20处理组β-catenin在第3天时明显高于对照组,其他时间点均较对照组有一定水平增高。Lef1在处理后第3天表达水平即高于对照组,之后各个时间点均明显高于对照组。FGF20处理组Tcf1在第3天时明显高于对照组,之后各个时间点无明显差异。（7）FGF20处理组Wnt5a和Lef1在处理后第3天即明显升高,且在处理后第7天、10天、14天均明显高于对照组。Tcf1虽然在处理后第3天,在FGF20处理组表达水平明显高于对照组,但在处理后第7天、10天、14天在FGF20处理组并无增高。3、FGF20促进毛囊再生:（1）通过新生小鼠表皮细胞和触须毛乳头培养细胞混合细胞注射到裸鼠皮内,我们成功构建Patch Assay模型。（2）FGF20处理组形成Patch Assay囊样结构体积明显大于对照组。FGF20处理组形成Patch Assay囊样结构新生毛囊数量明显多于对照组。（3）HE染色可见FGF20处理组所形成囊样结构体积明显比对照组增大,且结构更复杂。FGF20处理组所形成囊样结构包含更多类似毛囊样结构。结论:1、FGF20能促进培养触须毛囊生长。FGF20通过上调毛囊基质细胞增殖能力提高毛囊生长速度。2、FGF20能促进毛囊由静止期向生长期的周期转变。FGF20通过促进毛囊干细胞增殖分化调节毛囊周期转变。FGF20上调Wnt5a启动经典Wnt信号通路,进而调节毛囊周期转变。3、通过Patch Assay模型,我们首次成功构建新生小鼠表皮细胞和小鼠触须毛乳头细胞构成的嵌合毛囊。FGF20能提高新生小鼠表皮细胞和小鼠触须毛乳头细胞混合细胞再生毛囊的能力。4、FGF20有望成为促进毛囊生长/再生药物,具体机制、最佳浓度和处理时间需进一步探究。