马尔尼菲青霉cAMP依赖性蛋白激酶的功能初步研究

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马尔尼菲青霉是青霉属中唯一的两相条件致病真菌,在25℃时呈菌丝态,无致病性,37℃时呈酵母态,有致病性。它广泛分布于中国南部及东南亚地区,能引起呼吸道、皮肤以及系统性霉菌病,特别是在免疫功能低下和艾滋病病毒感染的患者中。尽管它具有非常重要的医学研究价值以及独特的温度调控的两相转换机制,但对马尔尼菲青霉的研究由于基因组信息和有效操作方法的缺乏而受到局限。  在本研究中,我们从实验室早期建立的马尔尼菲青霉cDNA文库中,筛选到了一个编码环腺苷酸依赖性蛋白激酶的cdpk基因。为了研究这个基因的功能,我们构建了相应的RNA干扰表达盒,利用gus’片段序列将cdpk七基因313 bp的正反序列片段隔开,并由受木糖诱导的xylP启动子来调控RNA干扰。整个RNA干扰载体通过根癌农杆菌介导转化马尔尼菲青霉,以博莱霉素为抗性标记进行突变子的筛选,成功获得稳定遗传的转化子。荧光定量PCR结果表明这些转化子cdpk基因的mRNA表达水平大大降低,RNA干扰效果明显。对转化子的表型进行研究发现,cdpk基因沉默后对菌体细胞的形态,孢子的萌发过程无明显影响,但是却减弱了菌落的生长速度,降低了红色色素的产量,并使马尔尼菲青霉几乎丧失了产孢功能,这暗示着叻七基因在马尔尼菲青霉孢子的形成中发挥重要功能,这些结果也可能为深入研究马尔尼菲青霉中的cAMP-PKA信号途径奠定了基础。
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