超声辅助梯度补料酶膜耦合制备玉米ACE抑制肽及其Fe2+螯合特性研究

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为了提高玉米ACE抑制肽产量,实现对其连续化高效生产,开发一种新型铁补充剂,本研究以玉米加工副产物玉米黄粉为原料,在多种补料方式和超声辅助方式基础上确定较优的补料和超声辅助条件,通过双频超声辅助梯度补料酶膜耦合技术对玉米ACE抑制肽进行连续化生产,使玉米肽产量得到进一步提高。同时探究超声对底物蛋白和产物肽结构的影响机理。此外,利用玉米ACE抑制肽与铁螯合反应制备新型铁补充剂,并从分子水平探究玉米肽与铁螯合反应机理以及螯合物的稳定性。主要研究结论如下:(1)通过补料方式和超声辅助方式对比试验得出梯度稀释补料方式和20/28k Hz双频聚能式超声辅助方式更合适,显著提高了多肽得率。优化获得的最佳工艺参数为:底物浓度10.86 mg/m L、加酶量7329 U/g、超声次数4次、酶解时间300 min,在此条件下,多肽得率和ACE抑制率分别为68.11%和86.09%,与未超声分步式酶解膜分离模式相比,多肽得率和蛋白质转化率的提高率分别达58.72%和41.59%,由此得出,双频超声辅助梯度稀释补料酶膜耦合制备方式是一种高效且连续化制备玉米ACE抑制肽的方法。(2)通过紫外光谱、荧光光谱、表面疏水性、巯基和二硫键含量、圆二色谱(CD)结果分析发现,超声处理改变了玉米蛋白和玉米肽的结构,表现为蛋白紫外特征吸收强度增加,荧光强度降低,表面疏水性和二硫键含量降低,分子间/内氢键结合力的增强;玉米肽表面疏水性和巯基含量升高,分子间/内氢键结合力的增强。超声处理对玉米蛋白和肽的二级结构影响不显著。扫描电镜(SEM)结果分析发现,超声处理使得玉米蛋白和肽表观结构变得不平整,有利于加速蛋白酶解反应,提高多肽得率。原子力显微镜(AFM)结果分析发现,超声处理使得玉米蛋白颗粒尺寸明显变小,颗粒总数量明显增多,分布变得更集中,也有利于提高多肽得率;玉米肽尺寸明显变大,聚集现象明显。氨基酸组成结果分析发现超声处理对玉米肽氨基酸组成影响不显著。(3)单因素和响应面试验优化获得了玉米ACE抑制肽-铁螯合物的最佳工艺参数为:抗坏血酸浓度2%、肽浓度10 mg/m L、肽铁比5:1、p H 10、反应温度20℃、螯合时间40 min。在此条件下,螯合率为66.39%,螯合物得率为82.87%,螯合物的ACE抑制率为82.21%,铁螯合处理对玉米肽ACE抑制活性没有显著影响,同时利用Na2S法定性检测证实了玉米肽-铁螯合物的生成,由此得到了一种玉米ACE抑制肽-铁补充剂的高效制备方法。(4)紫外光谱结果表明玉米ACE抑制肽确实与亚铁离子结合形成了螯合物使吸收峰蓝移且峰强度增大。红外光谱(FTIR)结果进一步证实了螯合物的生成,确定了羧基、氨基、羰基是玉米肽与亚铁离子螯合反应的主要位点。SEM和能量色散谱(EDS)结果发现了螯合物中存在Fe峰,证明了亚铁离子与玉米肽之间确实发生了螯合反应,且螯合物呈现紧实带有孔洞的表观结构。原子力显微镜和粒径分布结果表明螯合反应使螯合物颗粒粒径明显变小、分布更均匀集中。zeta电位分析结果显示螯合物表面负电荷显著减少,进一步证明了羧酸基团是肽侧链与亚铁离子结合的位点之一。X射线衍射(XRD)在2θ=12.22°处新形成了一个衍射峰进一步证明了螯合物的形成。氨基酸组成分析得出主要是肽中的酸性氨基酸Asp、Glu(总含量44.02%)和碱性氨基酸Lys、Arg(总含量14.57%)参与了铁螯合。(5)稳定性试验结果表明玉米ACE抑制肽-铁螯合物具有良好的热分解稳定性,最大热分解温度为195℃;在中性及碱性条件下(p H 6~10)具有良好的稳定性(保留率≥95.47%);在较宽的温度范围内(25~70℃)能保持较高的热稳定性(保留率≥85.10%);具有良好的耐胃肠酶消化性(保留率为79.18%),是一种稳定性良好的新型铁补充剂。
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