因为半月板组织解剖结构的独特性,所以半月板的损伤是很常见的骨科疾病,而通过外科手术技术很少能真正地重建半月板组织。半月板是纤维软骨组织,由纳米级胶原纤维交错相连构成半月板结构的基本框架,从微观上观察,它又分为三层不同结构,构成每一层结构的胶原纤维有各自排列模式。半月板损伤后,无血液供应部分不能再生,所以研究人员尝试利用组织工程技术来重建半月板。从目前国内外的研究发现,尚无一种单一材料和单一的制备技术能制备出具备半月板纤维软骨组织特征的组织工程支架。应用复合材料的原理和方法,将具有互补特性的两种或两种以上材料按一定比例和方式组合,制成兼备机械强度、可降解性和生物相容性的复合材料,并选择适宜的制备工艺,可以设计构造出能够满足组织工程支架所需的结构和性能优化的三维复合材料支架。目前复合材料种类繁多,而天然生物材料与人工合成高分子材料之间的复合,显现了良好的组织相容性及生物力学特性,适合应用在半月板这种组织构造比较特殊的软骨组织重建。在本课题中,根据人工合成材料聚乳酸(PLA)具备一定的机械强度,又有弹性,符合半月板的―双相‖特性,我们选用其作为生物材料中的基本成分,为了增加它的可降解性,将它与聚羟基乙酸(PGA)复合,为了改善它的生物相容性,我们又利用天然生物聚合物明胶对它进行表面修饰。同时,考虑到组织工程支架的形貌结构对引导细胞增殖方向,诱导组织形成起到关键作用,设计制备的支架就要很好地仿生组织的细胞外基质结构。静电纺丝技术能够制备纳米级的纤维结构支架,很好地仿生了细胞外基质的胶原纤维结构。根据前期工作,改变接收板材质为铜质,增加一个电场,先行应用静电纺丝技术制备聚乳酸聚羟基乙酸(PLGA)纤维结构的支架作为支架基底层,仿生半月板组织的细胞外基质纤维结构,再在plga纤维结构支架表面纺一层明胶纤维结构支架对plga进行表面修饰,制成双层结构支架,增加plga支架的亲水性和组织相容性。制备的支架兼具机械强度、可降解性和组织相容性。鉴于静电纺丝技术制备的支架达到一定厚度后,因高分子材料的绝缘性和电场力的限制,再想提高支架的厚度,有相当大的挑战。而热致相分离(tips)技术,使三维立体结构支架的厚度得到大大地改观,改良的梯度热致相分离技术,又使支架孔隙的排列走向得到控制。我们选用有韧性可降解材料聚3-羟基丁酸酯共聚4-羟基丁酸酯poly(3-hydroxybutyrateo-co-4-hydroxybutyrate),简称p(3hb-co-4hb),复合聚乳酸(pla),改善pla的降解性,利用梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)取向孔隙三维支架,再结合物理吸附作用,将天然生物聚合物明胶涂覆在支架表面,更加改善了支架的生物相容性,使其具备诱导细胞取向增殖,促进组织形成,发挥组织工程支架的作用。第一部分静电纺丝技术制备有机械强度和细胞相容性的双层纳米纤维结构半月板组织工程支架目的:1.利用静电纺丝技术制备组织工程支架。2.通过明胶纤维的表面修饰提高支架生物相容性。3.评估支架具备适合组织工程支架要求的物理化学性质。方法:在前期工作基础上,改进静电纺丝设备,将接收板改用铜质材料,并在接收板上增加一个新的电场,利用―层-层沉积‖技术,先纺出一层plga纤维结构支架作基底层,再纺制一层明胶(gelatin)纤维结构在其表面上沉积制备双层结构支架。同时以纯的plga和明胶混合plga分别各纺出一种纤维支架作为对照组。将三种支架的表征、亲水性、降解性和机械强度进行测试比较。结果:gelatin/plga双层纤维结构支架与另外两种支架对比,具备直径合适的纳米级纤维、有较大孔径、较高的孔隙率、较高的亲水性、满意的降解率和良好的机械强度。结论:明胶/plga双层纤维结构支架仿生了半月板组织细胞外基质结构,具备作为组织工程支架的理化特性。第二部分骨髓间充质干细胞诱导分化的半月板细胞种植支架联合培养目的:1.提取兔的骨髓间充质干细胞,进行诱导分化为半月板细胞。2.将细胞种植于前面制备的三种不同的纤维结构支架上,在体外进行培养。3.观察细胞在支架上的形态,通过细胞增殖情况及合成分泌功能的比较分析,评估不同支架的细胞相容性。方法:应用密度梯度离心法提取兔骨髓间充质干细胞,在软骨诱导培养基中培养,获得的纤维软骨细胞通过表征观察和特异性染色(h.e、甲苯胺蓝、ab-pas、i、ii型胶原免疫组化染色)进行鉴定。接种细胞于三种不同支架,通过观察细胞表征、组织染色、增殖测试评估三种不同支架对细胞的相容性及对细胞特性的保持。结果:提取的骨髓间充质干细胞可以诱导分化成半月板纤维软骨细胞,种植于支架后能够增殖,并保持纤维软骨细胞的表征和功能,尤其在明胶/plga双层纤维结构支架上增殖显著。结论:明胶/plga双层纤维结构支架接种经诱导分化的纤维软骨细胞的联合培养为组织工程技术重建半月板提供理论依据。第三部分制备具有生物相容性和机械强度的gelatin/pla/p(3hb-co-4hb)三维组织工程支架目的:1.改进的梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)三维多孔取向支架。2.在支架表面吸附明胶(gelatin)进行修饰,制备的支架进行表征、亲水性、降解性和机械强度的测试评估。3.支架上种植前面获得的诱导分化的骨髓间充质干细胞,评估支架的细胞相容性。4.与第一部分制备的gelatin/plga双层纤维结构支架进行机械强度和细胞相容性方面的对比。方法:应用改进的梯度热致相分离技术制备pla/p(3hb-co-4hb)三维多孔支架,用物理吸附方法以明胶对支架进行表面修饰,标记为gelatin/pla/p(3HB-co-4HB)支架,制备的支架与未经过修饰的PLA/P(3HB-co-4HB)支架进行表征、孔隙率、降解性、亲水性和机械力学性能的测试对比后,种植经诱导分化的骨髓间充质干细胞,通过观察细胞在支架上的生长,及细胞—支架复合体的特异性染色和扫描电镜、共聚焦显微镜观察情况进行对比分析,评估明胶修饰支架在细胞相容性方面的优越性。为了选择更优越的支架,再与第一部分制备的Gelatin/PLGA双层纤维结构支架进行拉伸强度和细胞种植支架增殖情况的对比。结果:梯度热致相分离技术制备的三维多孔支架经明胶修饰后,具备较理想的理化性质,种植其上的经诱导分化的骨髓间充质干细胞能够很好地增殖,并保持纤维软骨表征。与Gelatin/PLGA双层纤维结构支架对比,有更强的机械强度和优越的细胞相容性。结论:相比Gelatin/PLGA双层纤维结构支架,明胶修饰的PLA/P(3HB-co-4HB)三维立体结构支架更适于成为半月板组织工程支架。第四部分Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架负载诱导分化的干细胞植入裸鼠体内构建纤维软骨的实验研究目的:检测细胞—支架复合体植入裸鼠皮下构建纤维软骨组织。方法:首先测试支架的安全性,用支架浸提液进行皮下刺激试验和急性毒性实验。然后将前面实验中已经得到的经示踪剂染色的诱导分化干细胞负载于支架上构成复合体与单纯无细胞支架植入裸鼠皮下,进行培养4周后,在多功能活体成像系统下观察,确认支架内细胞存活、增殖。将裸鼠处死,取出细胞—支架复合体,制成切片,进行组织染色和免疫组化染色观察对比。结果:制备的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架是有生物相容性的,是安全的。负载诱导分化干细胞的支架植入裸鼠皮下后,可见支架内被标记的细胞增殖明显,细胞融合,相互联系,分泌纤维软骨细胞外基质。在支架环境中,有半月板纤维软骨组织形成的趋势。结论:负载诱导分化干细胞的Gelatin/PLA/P(3HB-co-4HB)支架于裸鼠皮下培养成纤维软骨组织,为组织工程技术重建半月板提供理论依据。