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动脉粥样硬化是严重危害人类健康的疾病,流行病学资料显示其发病率逐年递增,因此其发病机制也越来越受到关注。目前认为在动脉粥样硬化性血管疾病中,内皮功能障碍以及继发性炎症是动脉粥样硬化的始动和进展的关键环节。单核细胞源巨噬细胞是在血管壁炎症和动脉粥样硬化中起重要作用的炎性细胞,它与血管内皮细胞粘附,进而浸润到动脉内膜下成为巨噬细胞,通过清道夫受体吞噬大量脂质泡沫细胞化,形成富含脂质的易损斑块,这一系列的动态过程既是动脉粥样硬化进程的开始,也是已经形成的动脉粥样硬化斑块不稳定和破裂的原因。因此抑制单核细胞与血管内皮细胞的粘附可成为治疗动脉粥样硬化性血管疾病的有效策略。a-促黑素细胞激素(a-MSH)是一种由13个氨基酸组成的内源性神经肽,由前体激素阿黑皮素原(POMC)经蛋白裂解产生。a-MSH具有拮抗内毒素和促炎细胞因子等多种生物学效应,它能直接作用于外周免疫细胞上的促黑皮质素受体(MCR)进而下调促炎细胞因子的产生,也能作用于脑组织进而抑制外周免疫反应。诸多研究表明a-MSH是细胞因子的拮抗剂,它对几乎所有促炎细胞因子均有抑制作用,并能够促进白细胞介素-10(IL-10)等抗炎细胞因子的生成,因此a-MSH具有抗炎作用。但a-MSH是否可以阻止单核细胞与血管内皮细胞粘附,抑制血管内皮细胞炎症尚未有相关报道。在本课题中,我们采用人脐静脉血管内皮细胞作为研究对象,来探讨a-MSH对血管内皮细胞炎症反应的作用,通过对细胞粘附分子的表达以及NF-kB转录活性的研究,发现a-MSH可以通过与MC1R受体结合,抑制单核细胞与血管内皮细胞粘附,进而抑制血管内皮细胞的炎症,为阐明a-MSH治疗动脉粥样硬化性血管疾病的机制提供理论依据,同时也为临床治疗提供新的药物靶点。目的：研究a-MSH通过抑制单核细胞与血管内皮细胞粘附,进而抑制血管内皮细胞炎症发生,为a-MSH治疗动脉粥样硬化性血管疾病的机制提供新线索和理论依据。方法：本实验采用人脐静脉血管内皮细胞(HUVECs)和单核巨噬细胞系(THP-1)作为研究对象,分别在EBM-2和RPMI-1640培养基完成细胞培养。采用Trizol从培养细胞中完成RNA的提取；选取1μg的RNA作为模板进行逆转录聚合酶链反应合成cDNA;相应mRNA的水平通过荧光定量PCR反应以及相对于内参基因的表达量变化评估。将HUVECs随机分为两组,实验组加入a-MSH,而对照组不加入a-MSH,添加TNF-a培养诱导,采用0.2ml/L钙黄绿素红点进行标记；图片采用莱拉视频成像系统进行采集,从中随机抽取实验视野中的一个区域进行统计学分析。对每个实验视野区域的粘附细胞数量进行标准化计数并与对照组做出比较。HUVECs在室温下应用4%多聚甲醛固定,在冰上应用聚乙二醇辛基苯基醚进行透化作用；被标准化的山羊血清阻断；在室温下应用一抗、二抗培育孵化；细胞被固定在含有DAPI的VECTASHIELD载体介质上,应用三维荧光反卷积显微技术进行信号图像记录。HUVECs应用细胞裂解缓冲液进行细胞裂解,蛋白浓度由BCA蛋白检测法进行测定；提纯的蛋白质经过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),电转移至Immobilon-P膜上；依次采用一抗、二抗孵育；目的蛋白通过化学发光法以及凝胶成像系统进行检测。结果：我们首先研究a-MSH对于TNF-a介导的单核细胞对血管内皮细胞的粘附作用。]HUVECs在TNF-a刺激作用6小时后,分别加入5μg/ml和10μg/ml的a-MSH设立两个预处理组和未加入a-MSH的对照组。然后单层的HUVECs在被免疫荧光染料标记的单核细胞表面孵育。经过a-MSH预处理组与对照组相比,TNF-a介导的单核细胞对血管内皮细胞的粘附作用明显减弱；并且10μg/ml的a-MSH与5μg/ml的a-MSH两预处理组相比,10μg/ml的a-MSH预处理组的粘附作用减弱更明显,表明粘附作用的衰减与a-MSH呈现一定程度的量效关系。其次在mRNA水平对细胞粘附分子-1(VCAM-1)和E-选择素(E-selectin)进行了测定。在TNF-a的诱导下HUVECs分泌的VCAM-1和E-selectin在mRNA水平明显增加；而对之相对应的是,经过a-MSH预处理组,VCAM-1和E-selectin在：mRNA水平明显降低。进一步的研究发现,蛋白质水平的表达也同样显示a-MSH预处理组的VCAM-1和E-selectin明显降低。然后通过NF-κB荧光素酶质粒转染的HUVECs,在TNF-a的诱导下NF-κB荧光素酶活性明显增加。而这种增加的活性可以被a-MSH所减弱。此外,免疫荧光结果表明被TNF-a所诱导的p65核转位也可以被a-MSH所抑制。这也进一步证实了a-MSH对于NF-κB的抑制作用。通过siRNA转染血管内皮细胞中的MC-1R后,发现a-MSH对于单核细胞与血管内皮细胞之间的粘附的抑制作用几乎消失。更重要的是,荧光定量PCR结果表明,当MC-1R表达被siRNA转染抑制后,a-MSH对于VCAM-1和E-selectin的抑制作用也随之消失。荧光素酶报告实验进一步揭示a-MSH对NF-κB的活性抑制作用也会伴随MC-1R表达的下调而降低。结论：a-MSH可以抑制TNF-a介导的单核细胞对血管内皮细胞的粘附作用,VCAM-1和E-selectin在mRNA水平明显降低,蛋白印迹法证实a-MSH也可以抑制VCAM-1和E-selectin的蛋白表达。免疫染色结果表明被TNF-a所诱导的p65核转位也可以被a-MSH所抑制。这也进一步证实了a-MSH对于NF-κB的抑制作用。a-MSH对单核细胞对血管内皮细胞的粘附的抑制作用主要通过MC-1R发挥作用。