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本研究对α-淀粉酶基因的克隆、诱变和表达等进行了系统的研究。主要研究内容包括α-淀粉酶及其产生菌的快速鉴定新方法、高效感受态细胞的制备、α-淀粉酶基因的克隆和α-淀粉酶基因的体外诱变等四个主要方面。本研究结果为高酶活α-淀粉酶产生菌的筛选奠定了基础，有利于深入开展α-淀粉酶基因结构和功能关系的研究，并为基因的体外诱变找到了一条新的途经。 1．快速鉴定并筛选α-淀粉酶及其产生菌的新方法：锥虫蓝染料和淀粉由于静电非特异性吸附结合后使淀粉呈稳定的蓝色，当淀粉被淀粉酶水解后因分子变小吸附力减弱，而让锥虫蓝游离出来，游离的锥虫蓝被周围未水解的淀粉吸附而使颜色加深，淀粉水解区则形成无色、透明的水解圈。本研究将含锥虫蓝的培养基命名为LBSP。比较研究结果表明鉴定培养基的适宜条件是：锥虫蓝的使用浓度是0.005％-0.01％（w／v），培养基的用量为15ml／皿左右，并可以采用0.1MPa高压蒸汽灭菌。与传统的碘-淀粉法相比，本法不但操作简便，具有相同的灵敏度和使用范围，而且对淀粉酶及其产生菌没有任何不良影响。 2．高效感受态细胞的制备：高效感受态细胞的制备是分子生物学的关键技术之一，是DNA转化的基础。已知影响感受态细胞制备的因素很多，本研究从感受态细胞制备的影响因素和转化过程对转化效率的影响因素两个方面进行了研究。结果表明：在感受态细胞制备过程中高浓度的二价金属离子(Mn2+、Mg2+)对感受态细胞制备有害；不同的培养基对感受态细胞制备也有不同的影响；影响最大的是培养基的起始pH、培养时间和所用的器材的清洁度。本研究总结的在37℃条件下制备感受态细胞的适宜条件是：起始pH值为7.0，最适培养时间是1.2-1.5h，OD600值在0.053-0.110，器皿应用去离子水清洗至少三次以确保洁净。在转化过程方面对热激时间、热激温度、热激后的存放时间、转化容器洁净度、溶解介质、质粒大小、质粒浓度和贮存时间等进行了比较研究。结果表明：对转化效率影响的主要因素是质粒浓度和质粒大小；质粒浓度越低，转化效率越低，当浓度达到饱和后，继续增加质粒浓度，转化效率下降。质粒越大，转化效率越低。本研究在实验中对大质粒采用高效感受态细胞，小质粒采用普通感受态细胞均获得理想的转化效果。由于采用不同的转化方法对转化效率影响很大，常规转化、简单转化和快速转化的转化效率往往相差一到二个数量级，所以应根据不同的要求采用不同的转化方法。 3．α-淀粉酶基因的克隆：随着分子生物学的发展，克隆基因的方法越来越多，根据研究对象和要克隆的基因的背境。本研究分别选用了鸟枪克隆法、PCR和RT-PCR克隆法，成功地克隆到枯草芽胞杆菌（Bacillus subtilis）HN503、野油菜黄单胞菌（Xanthomonas campestris pv campestris）8004和米曲霉（Aspergillus口尽留‘）HN504的价淀粉酶基因。分别将克隆到的基因构建成的重组质粒命名为pHN503、pHN8o04和pHN504。在不知克隆基因的序列用鸟枪克隆法时，对总DNA抽提，酶切，酶连，转化等进行了研究。结果表明:主要影响因素是感受态细胞的转化效率，由于酶连产物的浓度一般都比较低，如果感受态细胞转化效率低就得不到转化子，从而无法建立总DNA文库;所以用鸟枪法克隆基因一定要用高效感受态细胞，并用 LBSP作选择培养基;采用载体去磷的方法制备载体。在已知基因序列的条件下用PCR和RT一CR克隆基因时，对PCR和RT一PCR的反应条件、产物的回收、回收产物的酶切、酶连和转化等条件进行了一系列的比较研究。结果表明:影响PCR和RT一PCR法克隆的主要因素是引物的设计、PCR和RT一PCR反应混合物组份比例与条件。在己知基因的序列条件下，借助电脑进行设计，然后合成引物，一般不难从供试生物基因组和mRNA中克隆到目的基因。 4.a一淀粉酶基因的体外诱变:本研究采用了紫外线体外诱变、基因体外截短诱变、倾向错误的PcR、DNA shuming技术和用5一澳脱氧尿昔三磷酸代替脱氧胸昔三磷酸等方法对a一淀粉酶基因进行了体外诱变。结果表明:紫外线对基因体外诱变无效;基因截短诱变能提高基因的表达量，从而提高a一淀粉酶的酶活，其最适方法是测定基因的序列后，合成引物用PCR的方法对基因进行截短。倾向错误的PCR是进行基因体外诱变的一个好方法，本研究总结的适宜条件是:在25闪的反应体系中，另外再添加导致倾向错误的PcR的Mncl21mM，增加Taq酶用量到5u，加入改变了碱基比例的EdN仰（1 dTTP:x dGTP:sdATP:sdCTP），模板量应控制在能出PCR带的最低浓度。本研究用此法己成功的获得酶活提高了的a一淀粉酶基因，并将含有此基因的重组质粒命名为pHN8004一1。DNA shuffiing技术是体外诱变的最新技术，据报道已成功的将基因的酶活提高了成千上万倍;但本研究虽然对此技术的许多因素进行了研究，但关键的加引物的PCR均未能扩增出预期的特征性产物，因此DNA shuffing技术还有待进一步研究。用5一澳脱氧尿普三磷酸代替脱氧胸营三磷酸对基因体外诱变是本研究的一个创新，其原理是利用碱基类似物的结构相似性来造成基因突变。本研究结果表明:在常规PCR的