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蜘蛛丝(Spider silk)是一种具有优越机械性能的天然高分子纤维丝蛋白,具有生物降解性。在国防、军工(防弹衣)、建筑、生物医疗等领域具有其他任何人造合成材料都无法比拟的应用前景,成为仿生学研究的主要目标。其力学性能与基因所编码的氨基酸及其序列组成有着密切的关系,蜘蛛同类相食的特性,使得只能通过基因工程的手段获得蛛丝,获得更多的蛛丝蛋白基因序列,探索和解析蛛丝蛋白基因结构特征,进而揭晓蛛丝基因特殊的进化关系对人工仿制蛛丝具有重要的意义。由于蛛丝蛋白编码基因较大(一般大于9kb),存在大量重复序列,重复区占整个蛛丝基因的序列90%以上,目前关于蛛丝基因完整序列的报道较少,世界上仅有美国加州大学实验室利用筛选基因文库的方法获得黑寡妇蜘蛛(Latrodectus hesperus)的主壶腹腺丝蛋白(Major ampullate spidroin, MaSp1/2)、葡萄状腺丝蛋白(Aciniform,AcSp),国内仅有本课题组报道了大腹园蛛(Araneus ventricosus)次壶腹腺丝蛋白(Minor ampullate spidroin, MiSp)全长编码基因序列的报道,其他报道大部分为部分基因或部分的cDNA序列。为获取大腹园蛛更多乃至全长MaSp1编码基因序列,基于实验室构建的大腹园蛛基因组文库,本论文开展了以下方面的工作：(1)大腹园蛛基因组的提取：利用目前对蜘蛛基因组DNA提取效率最高的方法—改良CTAB法提取大腹园蛛高分子量基因组DNA(High Molecular Weight Genomic DNA,HMW-gDNA),为减少外源基因的干扰,选择大腹园蛛胸部肌肉组织进行操作。该方法提取的基因组片段较长,纯度高,可满足分子生物学实验要求。(2) MaSp1基因的STS/3D-PCR筛选：根据NCBI公布的多种蜘蛛丝氨基酸序列,设计并合成MaSp1非重复区编码序列3’端的12对引物并进行PCR扩增。根据条带扩增及序列分析结果确定其中有一对引物MaSp1-up/MaSp1-down可用,产物经测序分析证实为MaSp1C端(275bp)非重复区部分编码序列,并确定为MaSp1的STS (Sequence tagged site)序列,利用此对引物对大腹园蛛Fosmid文库进行STS/3D-PCR筛选。将1042块384-well plates分成约26批次(每批次40块384-well plates),构建一级混合池(Primary pools)、二级混合池(Secondary pools)和超级池(Super pools)。基于STS/3D-PCR方法,对文库超级、一级和二级混合池进行筛选,得到含有MaSp1编码基因的阳性克隆AvMaSp1。(3)阳性单克隆高拷贝诱导：过夜活化菌液加入Copycontrol Induction Solution,配成理想的体系,诱导阳性单克隆质粒的高拷贝,整个过程需保证通气性良好,抽提重组pCC2FOSTM载体。(4)阳性克隆的鉴定：末端测序鉴定,利用载体末端序列设计并合成引物end-F和end-R,对阳性克隆进行测序,验证克隆内所含MaSp1基因的完整性。(5) AvMaSp1序列分析：通过末端测序鉴定插入目的片段的完整性,对包含目的基因的阳性克隆送上海生工生物工程技术服务有限公司进行Shotgun测序。利用DNAman、SerialCloner2-6-1、Clustal Omega、PSIPREDv3.3(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/)以及MEGA4.0对当前已获取的部分序列进行氨基酸组成分布、重复区特征、亲疏水性等分析。通过本项研究,在PCR基础上设计STS特异性筛选引物对文库进行STS/3D-PCR筛选,获得了携带大腹园蛛MaSp1编码基因的阳性克隆,经Shotgun测序得到了MaSp1基因新序列,对进一步深入研究和仿生“蛛丝”打下了良好的基础。