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急性肝损伤(Acute Liver Injury,ALI)是一种由多种病因引起的突发性疾病,在临床上具有极高的死亡率。天然植物提取物中含有丰富的抗炎和抗氧化活性成分,因而从植物中筛选具有保肝作用的活性物质已经成为预防和治疗ALI研究的新趋势。桑枝是一种常用中药,古代医书《本草再新》记载桑枝“味清苦,微寒,无毒,入肝经”;《随息居饮食谱》中记载“滋肝肾,充血液”。当代药理学研究表明,桑枝具有抗炎、抗氧化等生物活性,桑枝中很有可能含有保肝作用非常好的活性物质。然而,目前关于桑枝及其主要活性成分保肝作用的研究还缺乏系统性的证明。因此,本实验对桑枝提取物(Mulberry twigs extract,Ext)及其活性化合物拮抗脂多糖/D-氨基半乳糖(Lipopolysaccharide/D-galactosamine,LPS/D-GalN)诱导ALI的作用机制进行了研究,具体研究内容及结果如下:1.桑枝提取物缓解急性肝损伤的作用机制Ext显著改善LPS/D-GalN诱导的小鼠肝组织病理变化,降低血清中谷丙转氨酶(Alanine transaminase,ALT)和谷草转氨酶(Aspartate transaminase,AST)的水平,提高了抗氧化酶如超氧化物歧化酶(Superoxide dismutase,SOD)和过氧化氢酶(Catalase,CAT)的活性,抑制了脂质氧化产物丙二醛(Malondialdehyde,MDA)的生成。除此之外,Ext显著下调了丝裂原活化蛋白激酶(Mitogen-activated protein kinase,MAPK)信号通路相关蛋白的磷酸化水平,显著上调核转录因子E2相关因子2(Nuclear factor erythroid 2-related factor 2,Nrf2)的表达与血红素氧合酶(Heme oxygenase-1,HO-1)和奎宁氧化还原酶(NAD(P)H:quinoneoxidoreductase,NQO1)的表达。由此可知,Ext通过抑制MAPK信号通路和促进Kelch样环氧氯丙烷相关蛋白-1(Kelch-like epichlorohydrin-associated protein 1,Keap1)-Nrf2信号通路的激活,进而起到了缓解ALI的药理作用。2.桑枝提取物中主要活性物质含量分析采用HPLC法对Ext中主要二苯乙烯类化合物:氧化白藜芦醇(Oxyresveratrol,Oxy)、白藜芦醇(Resveratrol,Res)、桑皮苷A(Mulberroside A,MulA),主要黄酮类化合物:桑色素(Morin,Mor)、芦丁(Rutin,Rut)、槲皮素(Quercetin,Que)进行定量分析。结果表明,Ext中二苯乙烯类化合物的含量相较于黄酮类化合物具有显著优势,而Oxy的含量显著高于Res和MulA。因此,本研究选择对Oxy的保肝活性进行进一步的研究。3.Oxy缓解急性肝损伤作用的机制研究研究结果表明,Oxy能够缓解LPS/D-GalN诱导的小鼠肝组织病理变化;显著抑制LPS/D-GalN导致的ALT和AST水平升高;提高血清中抗氧化酶SOD和CAT含量以及总还原力(Total antioxidant capacity,T-AOC),降低诱导型一氧化氮合酶(Inducible nitric oxide synthase,iNOS)含量以及MDA水平;Oxy调控Toll样受体4(Toll-like receptor 4,TLR4)/核转录因子-κB(Nuclear factor-kappaB,NF-κB)信号通路相关蛋白的表达,降低小鼠肝组织中炎症因子白介素1β(Interleukin-1β,IL-1β)、白介素6(Interleukin-6,IL-6)、肿瘤坏死因子α(Tumor Necrosis Factorα,TNF-α)的表达;Oxy显著上调Nrf2的表达及核位移,提高其下游抗氧化基因HO-1和NQO1的表达;此外,Oxy显著抑制Caspase家族蛋白的活化,并促进磷脂酰肌醇3激酶(Phosphoinositide 3-kinase,PI3K)-蛋白激酶B(Protein kinase B,Akt)信号通路激活,进而提高B-cell lymphoma-2(Bcl-2)/Bcl-2Assaciated X protein(Bax)比值。由此可知,Oxy能够抑制TLR4/NF-κB信号通路的激活,促进Keap1-Nrf2信号通路的激活,促进PI3K-Akt信号通路激活,抑制Caspase家族蛋白的活化,发挥缓解LPS/D-GalN诱导的ALI的作用。4.Oxy、Res和MulA保护急性肝损伤作用的比较为了进一步探索Oxy缓解ALI作用与其结构的关系,本研究对Oxy及其结构类似物Res和MulA的保肝作用进行了比较。研究结果表明,Oxy、Res和MulA三者均显著抑制了LPS/D-GalN导致的ALT和AST水平升高,抑制活性MulA>Res>Oxy(P<0.01)。三者均显著提高血清中抗氧化酶SOD和CAT含量,MulA>Res>Oxy(P<0.01)。但在抑制MDA生成的能力,Res和Oxy显著优于MulA(P<0.05)。通过Western Blotting检测了Oxy、Res和MulA抑制TLR4/NF-κB信号通路的作用,结果显示,MulA抑制作用显著优于Oxy(P<0.01),Oxy显著优于Res(P<0.01)。Oxy、Res、MulA均促进Keap1-Nrf2信号通路的激活,MulA作用显著优于Oxy(P<0.01),Oxy显著优于Res(P<0.01)。然而,Oxy、Res和MulA在抑制caspase8活化的作用方面,Res作用显著优于Oxy(P<0.01),Oxy显著优于MulA(P<0.01)。基于以上研究结果表明,MulA相较于Oxy和Res具有更好的保护LPS/D-GalN诱导的ALI作用。本次研究表明,Ext及其主要二苯乙烯类化合物均具有很好的保肝活性。本研究为桑枝这一天然资源的开发与利用提供了理论基础,也为保肝功能性食品的研究与开发提供了物质基础。