背景根据2020年全球癌症负担数据,食管癌发病率和总死亡率均排名前10位,致死率不断攀升,且呈明显地域分布差异,河南省北部林州及其毗邻地区是食管癌高发区。与西方食管癌多为腺癌不同的是,中国的食管癌90%以上为食管鳞癌。食管鳞癌发病机制不清,患者早期缺乏特异性症状使得患者5年总体生存率仍徘徊在15%左右。本课题组前期研究已经证实YAP调控食管鳞癌的发生发展,在食管鳞癌细胞中敲除YAP基因后,进行RNA-Seq数据分析,意外发现“别吃我”信号CD24是YAP的关键下游基因,YAP是否通过调控CD24的表达促进食管鳞癌的免疫逃逸还有待证实。目的阐明YAP是否通过调控CD24驱动食管鳞癌免疫逃逸,为食管鳞癌发生发展机制提供理论支撑及新的免疫治疗靶标。方法1.利用CRISPR/Cas9基因编辑技术在ECA9706和ECA109中敲除YAP基因,并通过PCR实验和基因测序评估YAP敲除效果。2.在ECA9706和ECA109中敲除YAP后,通过CCK8细胞增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验评估食管鳞癌细胞在YAP敲除后的表型变化。3.将野生型细胞与YAP敲除的ECA9706和ECA109细胞进行RNA-seq分析,探讨YAP影响食管鳞癌细胞增殖、迁移、侵袭的机制。4.在ECA9706和ECA109中敲除YAP后,通过流式细胞术、免疫荧光实验、Western blot实验、qPCR实验评估YAP基因敲除是否会下调食管鳞癌细胞CD24的表达。5.通过流式细胞术和共聚焦成像两种方法评估YAP基因敲除是否上调巨噬细胞对食管鳞癌细胞的吞噬能力。6.在ECA9706和ECA109中构建YAP持续激活（YAP-5SA）的慢病毒稳转株和TEAD结合位点突变（YAP-5SA-S94A）的慢病毒稳转株。通过流式细胞术、免疫荧光实验、Western blot实验、qPCR实验,评估YAP持续激活是否上调食管鳞癌细胞CD24表达。7.利用流式细胞术和共聚焦成像两种方法验证在YAP持续激活状态下是否会下调巨噬细胞对食管鳞癌细胞的吞噬能力。8.通过ChIP实验和双荧光素酶报告实验两种实验方法同时验证YAP是否能够调控CD24的转录激活。9.在223例临床随访数据完整的食管鳞癌组织芯片中分析YAP和CD24表达水平与食管鳞癌患者临床分期与TNM分期的相关性。10.对223例临床随访数据完整的食管鳞癌组织芯片进行免疫组化染色,运用Cox比例风险回归模型对影响食管鳞癌患者预后的多个因素进行单因素和多因素分析,评估YAP和CD24过表达是否是食管鳞癌患者预后差的独立危险因素。11.构建小鼠食管鳞癌诱导模型,利用YAP抑制剂维替泊芬干预,评估YAP抑制剂对小鼠食管鳞癌发病率以及对小鼠生存期的影响。结果1.PCR实验和基因测序结果显示在ECA9706和ECA109中YAP基因敲除成功。2.CCK8细胞增殖实验、平板克隆实验、Transwell实验结果表明YAP基因敲除后食管鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力显著下降。3.将野生型细胞与YAP敲除的食管鳞癌细胞进行RNA-seq分析,发现CD24是受YAP调控的关键下游分子。4.流式细胞术、免疫荧光实验、Western blot实验、qPCR实验结果显示YAP基因敲除后CD24表达水平明显下调。5.流式细胞分析和共聚焦成像结果显示YAP基因敲除后巨噬细胞对食管鳞癌细胞的吞噬能力显著增强。6.流式细胞术、免疫荧光实验、Western blot实验、qPCR实验结果显示YAP持续激活能够上调食管鳞癌细胞中CD24表达水平。7.流式细胞分析和共聚焦成像结果显示YAP持续激活能够下调巨噬细胞对食管鳞癌细胞吞噬能力。8.ChIP实验和双荧光素酶报告实验均表明YAP能够调控CD24的转录激活。9.223例临床随访数据完整的食管鳞癌组织芯片的YAP和CD24免疫组化染色结果显示YAP和CD24的表达与食管鳞癌患者TNM分期和临床分期具有显著相关性。10.223例临床随访数据完整的食管鳞癌组织芯片的YAP和CD24免疫组化染色结果显示YAP和CD24均是影响食管鳞癌患者预后的独立危险因素。11.维替泊芬干预后,小鼠食管鳞癌发病率显著下降,生存期显著延长。结论YAP基因敲除后能够显著下调食管鳞癌细胞的增殖、迁移、侵袭能力;YAP和CD24的表达与食管鳞癌的TNM分期呈显著相关性,YAP和CD24表达高者预后较差;YAP基因可调控“别吃我”信号CD24表达,促进食管鳞癌免疫逃逸。