论文部分内容阅读
在实验性病理条件下,纹状体与皮层等非神经发生区存在神经元新生。大量研究显示缺血损伤能诱导梗塞周边区发生血管增生和神经元新生。在大鼠脑内过表达或注射血管生成蛋白VEGF能同时增加缺血损伤脑内的血管增生和神经元新生。本实验通过纹状体注射pTIE2-GFP质粒示踪GFP免疫阳性(GFP+)内皮来源细胞的分化,研究血管增生在缺血诱导神经元新生中的作用。并通过侧脑室注射VEGF表达质粒和对照质粒观察过表达VEGF对MCAO术后大鼠缺血纹状体内血管增生与神经元新生的作用。随后,采用免疫荧光多标记与激光共聚焦扫描技术检测缺血脑内血管增生、神经元新生与胶质增生的变化。最后,结合免疫荧光多标记与全细胞膜片钳记录进一步分析缺血脑内GFP+细胞形态学和电生理学特性。研究显示,缺血诱导的增生内皮细胞(GFP+)能表达不同类型神经元标记物并具有动作电位发放。实验结果总结如下：1.缺血脑内内皮源性和不同发育时期神经元性蛋白呈时间依赖的表达免疫组化结果显示,MCAO术后3天至2周大鼠缺血纹状体内vWF、nestin、DCX与Tuj-1呈现时间依赖的表达。缺血侧纹状体内vWF+细胞在缺血再灌3天显著增加,再灌1周和2周时减少,但仍高于假手术组。同时,缺血损伤诱导nestin+细胞数量在缺血再灌3天时增加,而DCX+与Tuj-1+细胞数量在再灌1周时明显增多。免疫荧光三标结果显示缺血脑内激活的星形胶质细胞(GFAP+)与内皮细胞(vWF+)分布在神经元(NeuN+)周围,共同支持周围的神经元。以上结果提示,作为神经血管单元的主要成分,星形胶质细胞、内皮细胞和神经元在脑缺血损伤的病理过程中具有一定联系。2.缺血脑内GFP+内皮细胞向神经元的转分化pTIE2-GFP质粒注射后3天即可在大鼠缺血侧纹状体观察到绿色荧光细胞,且绿色荧光表达可持续至质粒注射后8周。采用免疫荧光多标记分析GFp+细胞的细胞类型,结果显示在缺血再灌3天,75%GFP+细胞为vWF+成熟内皮细胞,而仅有小部分GFP+细胞表达内皮祖细胞标记物CD34+(17%)或CD133+(9%)。在此实验条件下通过免疫荧光技术检测GFP与多种神经标记物的共定位情况,研究缺血纹状体内内皮来源细胞能否转化为内皮祖细胞或神经前体细胞。结果显示,在缺血再灌3天缺血侧纹状体内存在GFP+-Sox2-或GFP+-nestin+神经干细胞和GFP+-Pax6+神经前体细胞。GFP+-nestin+神经干细胞和GFP+-Pax6+神经前体细胞数量在缺血再灌3天达到高峰,而在1周和2周显著下降。但是在缺血脑内并未观察到GFP+-Oligo2+或GFP+-GFAP+细胞的存在。以上结果提示,缺血损伤脑内部分内皮来源的细胞可转分化为神经干细胞或神经前体细胞参与神经元新生。进一步研究显示缺血脑内GFP+细胞中的DCX(GFP+-DCX+神经母细胞)、Tuj-1(GFP+-Tuj-1+幼稚神经元)和MAP-2(GFP+-MAP-2+成熟神经元)呈时间依赖性地表达。此外,在再灌4周的缺血侧纹状体内,部分GFP+细胞可分化为GFP+-GAD67+GABA能神经元,极少量GFP+细胞可分化为GFP+-ChAT+胆碱能神经元。以上结果说明缺血损伤脑内增生的内皮细胞能分化为成熟的神经元,并进一步分化为不同类型的神经元。选取缺血再灌8周的大鼠脑片进行全细胞膜片钳记录,分析GFP+细胞的电生理活动以研究内皮来源的神经元是否具有成熟神经元的电生理特性。结果显示部分GFP+细胞(26个GFP+细胞中的16个细胞)表现出成熟神经元的静息膜电位(V(res))、膜电容(Cm)与膜输入电阻(Rin),其细胞膜能去极化产生动作电位,并且具有自发性突触后电流。以上结果提示,部分内皮来源细胞能最终分化为成熟的并具有功能的神经元。3.过表达VEGF促进缺血侧纹状体内内皮来源的神经元新生免疫荧光标记结果显示,在缺血再灌2周,phVEGF-DsRed注射组动物脑内GFP+细胞数量显著高于pDsRed注射组。同时,过表达VEGF能显著增加缺血侧纹状体内GFP+-MAP-2+细胞数量及其占GFP+细胞的比例。以上结果提示VEGF通过促进血管增生和GFP+内皮细胞转分化增加缺血诱导的神经元新生。4.VEGF通过其受体促进突触囊泡蛋白磷酸化直接调节神经元活动体外实验结果显示,原代培养的皮层与海马神经元能表达VEGF及其受体Flk-1。高钾刺激诱导神经元去极化,同时引起培养神经元与提取的大鼠突触体内VEGF的释放。此外,VEGF促进原代培养神经元内囊泡相关蛋白synapsin的磷酸化,而其Flk-1受体拮抗剂SU1498能抑制VEGF此作用。以上结果提示,VEGF通过与其受体Flk-1相互作用促进synapsin磷酸化从而直接调节神经元活动。结论：本文首次提出缺血纹状体内内皮来源的细胞具有神经干细胞特性,并能进一步分化为形态和功能成熟的神经元,整合入原有的神经网络,提示血管增生在缺血损伤后脑内神经血管单元重塑过程中发挥重要作用。