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研究目的:正畸牙齿移动过程中,机械力作用于牙齿并传导至牙周组织,力学信号转换为生物化学信号,引起牙周组织的改建,导致牙齿发生移动。正畸牙齿移动的生物学基础是骨改建,同时也为正畸治疗提供理论依据。而影响牙槽骨改建的因素很多,机械力和低氧刺激是其中两个至关重要的因素。成骨细胞在骨组织改建动态平衡中处于核心地位。本实验从细胞分子水平着手,进一步探讨应力作用下低氧信号通路HIF-1α/Twist1对骨改建的作用机制,进一步阐明力环境诱导的成骨分化过程中的作用及机制,并为临床治疗寻求更加科学合理的正畸治疗手段提供理论依据。研究方法:体外培养大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)力加载模型,首先施加周期性张应力组为实验组,即对BMSCs加载频率为1Hz,应力拉伸变形幅度为5%,分别持续0.5h、2h、6h、8h、12h。对照组0h组,共6组细胞在相同培养条件。应用Western blot和q PCR检测各组骨髓间充质干细胞在不同应力加载时间下Twist1基因的蛋白及mRNA表达情况;筛选出沉默效果最佳慢病毒载体后,构建沉默表达Twist1的稳定的BMSCs。以未感染慢病毒为正常组,沉默干扰Twist1为实验组,感染阴性病毒为对照组,对3组细胞加载最适成骨分化的张应力,研究力学刺激、BMSCs的成骨分化、低氧信号通路HIF-1α/Twist1三者之间的关系,并探究低氧信号通路HIF-1α/Twist1在周期性张应力诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化中的作用及机制。研究结果1.大鼠骨髓间充质干细胞(BMSCs)体外培养和生物学性能鉴定:将购得的BMSCs通过体外贴壁培养、传代扩增后,细胞生长逐渐稳定,形态呈现出均一的长梭形。传至第3~5代的BMSCs密度分布均匀,呈现有序的成纤维细胞样。BMSCs冻存复苏后其生长速度和状态均无显著改变,性能稳定。流式细胞仪检测结果显示,细胞表面抗原CD45呈阴性,为17.5%,而表面抗原CD44和CD90表达呈阳性,分别为96.8%,91.4%,上诉结果与大鼠骨髓间充质干细胞表面特异性抗原一致。2.检测周期性张应力诱导BMSCs成骨分化过程当中Twist1在蛋白和mRNA水平的表达:加力0h组大鼠BMSCs内Twist1表达量少,经周期性张应力刺激后,随着加力时间延长,Twist1在mRNA和蛋白水平的表达特异性增强,并在加力6h组其表达量达到高峰。并且Twist1在蛋白水平表达与mRNA水平表达呈现出较为相同的趋势。表明机械力刺激诱导BMSCs成骨分化过程中,Twist1的表达特异性增加。提示Twist1因子可能通过低氧信号通路HIF-1α/Twist1参与到周期性张应力作用下的BMSCs成骨分化过程。3.筛选并构建沉默表达Twist1的大鼠骨髓间充质干细胞的稳定株:本实验将购买的根据大鼠Twist1基因序列设计的四个sh RNA干扰靶点,并分别构建四组sh RNA慢病毒感染稳定株,对照组为阴性慢病毒感染组,正常组未感染病毒组共6组。通过q PCR评价干扰载体对靶基因的干扰效果,晒下结果显示sh RNA1沉默效果最佳,选择沉默效果最佳的sh RNA1感染靶细胞构建稳定株。4.初步探究低氧信号通路HIF-1α/Twist1在周期性张应力大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程中的作用:对正常细胞组、沉默干扰Twist1细胞组、病毒阴性感染对照组,共3组分别加载周期性张应力(拉伸强度5%、频率1Hz、时间6h),并采用Western blotting和q PCR检测三组细胞加力后成骨相关转录因子2(Runt related transcription factor 2,Runx2)、骨形成蛋白2(bone morphogenic protein2,BMP-2)基因的蛋白和mRNA表达变化。正常细胞中大鼠骨髓间充质干细胞表达少量BMP-2,但沉默干扰表达Twist1后,BMP-2蛋白和mRNA表达活性明显升高(p<0.05),而且对照组相对正常组中BMP-2表达未发生明显变化(p>0.05)。正常组BMSCs的Runx2蛋白和mRNA表达少,沉默干扰Twist1后其表达均特异性升高(p<0.05),且对照组细胞Runx2的mRNA和蛋白表达相对正常组未发生明显变化(p>0.05)。研究结论:1.周期性张应力诱导大鼠骨髓间充质干细胞体外成骨分化过程中Twist1在蛋白和mRNA水平的表达均特异性增强,表明力学刺激诱导BMSCs成骨分化过程中,Twist1做出阳性表达反应。从分子水平验证了低氧信号通路HIF-1α/Twist1参与了力环境下成骨分化的过程。2.沉默表达Twist1基因,即阻断低氧信号通路HIF-1α/Twist1后,可促进周期性张应力诱导的大鼠骨髓间充质干细胞成骨分化过程。