研究背景动脉粥样硬化引起的心血管事件是糖尿病患者的主要死因。糖尿病动脉粥样硬化所致的大血管病变具有病情进展快、病变程度重、治疗反应欠佳等特点,但具体机制尚不清楚。越来越多的证据表明以糖尿病为首的代谢异常可以通过触发系统性慢性炎症介导动脉粥样硬化的发生发展,因此,控制代谢异常引起的系统性慢性炎症是治疗糖尿病动脉粥样硬化的有效手段。I内脏脂肪组织是糖尿病系统性炎症的重要来源。由于进化同源、发育同胚层及细胞信号通路相互交联,脂肪组织代谢功能和免疫功能关系密切。2型糖尿病状态下内脏脂肪组织代谢负荷增加,发生显著的胰岛素抵抗,胰岛素抵抗可介导脂肪组织产生炎症反应,炎症通路显著激活,炎症因子分泌增加并释放入血,引起全身系统性慢性炎症,介导包括血管在内的远隔器官损伤。因此,控制内脏脂肪组织炎症将有望成为减缓糖尿病系统性炎症和治疗糖尿病大血管并发症的重要策略,内脏脂肪组织代谢异常与脂肪组织炎症的具体联系机制可能是控制糖尿病脂肪炎症的有效靶点。CD4+T细胞是内脏脂肪组织代谢异常与免疫功能紊乱的重要桥梁。一方面,代谢异常的脂肪细胞及间充质干细胞能够通过直接接触和旁分泌的形式作用于CD4+T细胞,CD4+T细胞发生炎性极化,促炎表型细胞(Th1、Th17)比例增加,抑炎表型细胞(Treg)比例减少,脂肪组织代谢功能异常通过CD4+T细胞促炎/抑炎比例平衡的改变反映,因此CD4+T细胞是代谢炎症信号的承载者;另一方面,CD4+T细胞促炎与抑炎比例平衡的变化进一步影响组织内细胞因子的平衡,促炎细胞因子增加,抑炎细胞因子减少,直接引起巨噬细胞M1型极化和脂肪组织炎症的扩布,因此,CD4+T细胞又是代谢炎症信号的传递者。改善CD4+T细胞极化状态将为控制糖尿病脂肪组织炎症提供新的线索和思路。糖尿病来源内脏脂肪间充质干细胞可能是CD4+T细胞炎性极化的重要诱因。脂肪间充质干细胞是脂肪组织内部具有多向分化能力的干细胞。生理状态下脂肪间充质干细胞具有强大的免疫抑制作用,能够抑制免疫细胞的增殖和极化;有报道发现肥胖个体来源内脏脂肪间充质干细胞发生功能紊乱,能够明显促进CD4+T细胞向促炎表型Th1、Th17分化,介导下游单核-巨噬细胞的激活,因此代谢异常的内脏脂肪间充质干细胞是CD4+T细胞炎性极化的重要诱因之一。但2型糖尿病状态下脂肪间充质干细胞的生物学特性及其对CD4+T的极化作用未见报道。非受体样蛋白酪氨酸磷酸酶 2(Protein tyrosine phosphatase non-receptor type 2,PTPN2)是CD4+T细胞炎性极化的重要调节分子。PTPN2又称T细胞蛋白酪氨酸磷酸酶(T cell protein tyrosine phosphatase,TCPTP),首先克隆于人类 T 细胞 cDNA库,后发现广泛表达于多种组织和细胞中。PTPN2通过磷酸酶的功能,降低信号分子的磷酸化水平,调节细胞信号转导。PTPN2通过显著抑制T细胞受体(TCR)和细胞因子介导的T细胞活化,维持T细胞静息状态,对T细胞的发育和功能及机体免疫稳态产生重要影响。Ptpn2-/-小鼠全身免疫状态出现紊乱,小鼠体内炎症增加,外周血和小肠内Th1及Th17细胞含量明显增加,而Treg细胞含量明显减少。但是PTPN2与2型糖尿病脂肪组织CD4+T细胞的促炎表型分化的关系尚不明确。PTPN2/p-STAT3可能是调节脂肪组织CD4+T细胞极化的关键通路。信号转导与转录激活因子 3(Signal Transducer and Activator of Transcription 3,STAT3)是重要的转录因子,介导多种蛋白的表达,调控细胞的增殖、分化、炎症等重要生理过程,磷酸化STAT3(p-STAT3)是活性形式。STAT3是CD4+T细胞炎性极化的重要转录因子,能够促进CD4+T细胞向Th1和Th17分化。研究发现PTPN2对JAK-STAT通路有调控作用,其中p-STAT3是PTPN2的主要底物,PTPN2可以通过降低STAT3磷酸化水平抑制其功能。但是目前PTPN2是否能够通过上述机制调节糖尿病脂肪组织CD4+T细胞极化仍待进一步研究。此外,前期筛选发现与T细胞极化相关的转录因子STAT3和FoxP3可能与Ptpn2基因上游非表达序列结合,转录因子STAT3和FoxP3是否会与Ptpn2基因启动子结合,调节PTPN2转录和表达尚未见报道。综上,我们提出研究假说:2型糖尿病状态下内脏脂肪组织间充质干细胞发生代谢异常和免疫功能紊乱,通过与CD4+T细胞作用介导其炎性极化,细胞内STAT3磷酸化水平显著增加,促炎表型Th1、Th17增加,抑炎表型Treg减少,进一步引起巨噬细胞MI型极化和脂肪组织炎症扩布;PTPN2于CD4+T细胞内过表达后能够降低胞内STAT3磷酸化水平,促炎表型Th1、Th17减少,抑炎表型Treg增加,进而抑制巨噬细胞炎性极化,阻断脂肪间充质干细胞向巨噬细胞的炎症传递和扩布;转录因子STAT3和FoxP3通过与Ptpn2启动子结合调节PTPN2的转录和表达。研究目的(1)研究2型糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞的生物学特性和对CD4+T细胞的极化诱导作用:(2)研究PTPN2是否能够通过减轻CD4+T细胞炎性极化抑制脂肪代谢性炎症的扩布及其具体机制;(3)研究Ptpn2基因的启动序列及STAT3和FoxP3在转录水平调节PTPN2表达的机制:研究方法(1)利用高脂喂养联合小剂量链脲佐菌素(Streptozocin,STZ)注射(75mg/kg)的方法构建2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型。(2)通过流式细胞学技术分析附睾脂肪血管基质成分(Stromal-Vascular Fraction,SVF)中CD4+T细胞浸润及极化状态;通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测SVF中促炎与抑炎细胞因子分泌。(3)利用Ⅱ型胶原酶消化及贴壁法分离附睾脂肪间充质干细胞,并使用DMEM完全培养基进行细胞培养。(4)利用CCK-8法、流式细胞学技术、ELISA、免疫印迹法检测脂肪间充质干细胞的生长、特征标记、胰岛素敏感性、免疫促炎与抑炎分子表达以及炎症通路的活化情况。(5)通过免疫磁珠分选技术分离小鼠脾CD4+T细胞并进行培养。(6)将CD4+T细胞与脂肪间充质干细胞行共培养,通过CFSE染色法及CCK-8法检测脂肪间充质干细胞对CD4+T细胞增殖抑制作用;通过流式细胞学技术及ELISA检测脂肪间充质干细胞对CD4+T细胞极化诱导作用。(7)通过激活离心法将过表达腺病毒FM/Ad5-PTPN2转入CD4+T细胞,通过检测GFP表达验证病毒的转染效率。(8)将转入病毒的CD4+T细胞与脂肪间充质干细胞进行共培养,检测PTPN2是否抑制糖尿病脂肪间充质干细胞对CD4+T细胞极化诱导作用。(9)将共培养后CD4+T细胞与巨噬细胞RAW264.7行共培养,通过粘附实验、迁移实验以及氧化低密度脂蛋白吞噬实验,检测糖尿病脂肪间充质干细胞诱导的CD4+T细胞对巨噬细胞功能的影响及PTPN2过表达后效应;通过流式细胞学检测巨噬细胞M1、M2型标记分子(CD11c、CD206),免疫印迹法检测M1、M2型胞内蛋白(iNOS、Arg-I),ELISA检测促炎细胞因子(TNF-α、IL-6)分泌,检测糖尿病脂肪间充质干细胞诱导的CD4+T细胞对巨噬细胞极化的影响及PTPN2过表达后的效应。(10)用CD4+T细胞-巨噬细胞共培养上清培养正常脂肪间充质干细胞,免疫印迹检测CD4+T细胞介导的脂肪间充质干细胞炎症扩布及PTPN2过表达后的效应。免疫印迹法检测糖尿病脂肪间充质干细胞诱导的CD4+T细胞PTPN2表达、STAT3表达及磷酸化水平,T细胞极化转录因子的表达;免疫共沉淀技术检测CD4+T细胞内PTPN2与p-STAT3结合能力。(11)通过基因序列检索、大片段PCR反应、载体连接与限制性内切酶双酶切反应、质粒转化与扩增,构建以小鼠Ptpn2基因上游启动序列为启动子的报告基因质粒pGL-3-1742 promoter,通过双荧光素酶报告基因实验验证该序列的启动子活性。(12)通过在线启动子分析软件ALGGEN_PROMO分析Ptn2基因上游启动序列中转录因子STAT3和FoxP3的结合位点;通过染色质免疫沉淀实验(ChIP)检测转录因子STAT3和FoxP3是否与启动序列结合以及结合的具体位置,并检测共培养后转录因子与启动序列的结合强度;通过双荧光素酶报告基因实验检测转录因子STAT3和FoxP3对pGL-3-1742 promoter转录活性的调节。结果(1)成功通过高脂喂养联合小剂量STZ腹腔注射构建2型糖尿病ApoE-/-小鼠模型。(2)与对照组相比,糖尿病组小鼠SVF中CD4+T细胞(CD3+CD4+细胞)比率明显增加,促炎表型CD4+T细胞(CD4+IFN-γ+,CD4+IL-17A+细胞)比率显著增加,抑炎表型CD4+T细胞(CD4+CD127-/细胞)比率显著降低,糖尿病组SVF培养上清中促炎细胞因子IFN-y含量明显增加,而抑炎细胞因子TGF-β含量明显降低。(3)成功通过酶消化及贴壁法分离、培养脂肪间充质干细胞,与正常对照组相比,糖尿病来源脂肪间充质干细胞形态及生长特性无显著差别,二者均表达间充质干细胞特征标记分子CD29、CD105,Pref-1,基本不表达CD34和CD45。(4)与正常对照组脂肪间充质干细胞相比,2型糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞Pref-1表达减少,在小剂量胰岛素刺激胰岛素通路蛋白无改变,发生较明显的胰岛素抵抗。(5)与正常对照组脂肪间充质干细胞相比,2型糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞分泌的抑炎细胞因子前列腺素E2(PGE2)显著降低,而诱导CD4+T细胞炎性极化的表面分子MHC-Ⅱ及共刺激分子CD40、CD80表达显著增加:2型糖尿病小鼠脂肪间充质干细胞在小剂量胰岛素刺激后Erk磷酸化水平降低,而NF-κB p65磷酸化水平显著增加。(6)与正常对照组脂肪间充质干细胞相比,2型糖尿病来源的脂肪间充质干细胞对CD4+T细胞的增殖抑制作用明显减弱。(7)与正常对照共培养体系相比,与2型糖尿病来源脂肪间充质干细胞共培养的CD4+T细胞促炎表型(CD4+IFN-γ+,CD4+IL-17A+细胞)比率明显增高,共培养体系中促炎细胞因子IFN-y明显增高,抑炎表型(CD4+CD127-细胞)比率明显降低,抑炎细胞因子TGF-β明显降低;促炎表型与抑炎表型细胞之比显著增加。(8)CD4+T细胞内过表达PTPN2能够明显抑制2型糖尿病脂肪间充质干细胞的炎性极化诱导作用,促炎表型明显减少,促炎细胞因子IFN-γ、IL-17A明显降低,抑炎表型(CD4+FoxP3+细胞)明显增加,抑炎细胞因子TGF-β明显增加,促炎与抑炎表型细胞之比明显降低。(9)与对照组共培养CD4+T细胞相比,糖尿病组共培养CD4+T细胞能够使巨噬细胞粘附数目明显增加,迁移数目明显增加,吞噬ox-LDL的细胞比率显著增加;与糖尿病组共培养CD4+T细胞相比,过表达PTPN2的CD4+T细胞使巨噬细胞粘附数目显著减少,迁移数目明显减少,吞噬ox-LDL的细胞比率显著减少。(10)与对照组共培养CD4+T细胞相比,糖尿病组共培养CD4+T细胞介导巨噬细胞M1型(F4/80+CD11c+细胞)比率明显增加,M2型(F4/80+CD206+细胞)比率明显降低,M1与M2型细胞之比明显增高,M1型巨噬细胞标志蛋白iNOS表达明显上调,iNOS/Arg-1明显增高,共培养上清中炎症因子TNF-αα显著增加;与糖尿病组共培养CD4+T细胞相比,PTPN2过表达的CD4+T细胞介导的巨噬细胞M1型比率明显降低,介导的M2型比率明显增高,M1与M2型细胞之比明显回落,M1型巨噬细胞标志蛋白iNOS表达明显受到抑制,iNOS/Arg-1明显降低,细胞因子TNF-α、IL-6含量也明显降低。(11)与正常对照共培养上清刺激组相比,2型糖尿病共培养上清刺激后脂肪间充质干细胞内p65磷酸化水平明显增高,无胰岛素刺激时Akt磷酸化水平明显增高,;与2型糖尿病共培养上清刺激组相比,PTPN2过表达共培养上清刺激后脂肪间充质干细胞内p38磷酸化水平明显下降,p65磷酸化水平明显下降,Akt磷酸化水平下降。(12)免疫印迹实验提示,与对照组相比,与2型糖尿病脂肪间充质干细胞共培养后CD4+T细胞PTPN2表达无显著差异,STAT3磷酸化水平增高,促炎表型Th1、Th17转录因子T-bet、ROR-yT表达增高,抑炎表型Treg转录因子FoxP3降低,(T-bet+ROR-γT)/FoxP3比值增高;与2型糖尿病共培养组相比,PTPN2过表达组CD4+T细胞PTPN2蛋白表达明显增加,STAT3磷酸化水平显著降低,促炎表型转录因子T-bet显著降低,ROR-γT表达无显著差异,FoxP3表达显著增加,(T-bet+ROR-γT)/FoxP3 比值降低。(13)免疫共沉淀实验提示,PTPN2能够与p-STAT3结合;与对照组相比,PTPN2/p-STAT3之比显著降低,Input中STAT3磷酸化水平同时增高;过表达PTPN2后PTPN2/p-STAT3之比明显增加,Input中STAT3磷酸化水平同时降低。(14)通过大片段PCR成功克隆出小鼠Ptpn2基因-1676bp～+66bp的序列,全长1742bp,与数据库小鼠基因序列比对正确;成功构建pGL-3-1742promoter报告基因质粒,双荧光素酶报告基因结果显示该序列具有启动子活性。(15)ChIP结果显示转录因子STAT3能够与预测位点结合,FoxP3能够与部分预测位点结合;双荧光素酶报告基因实验显示转录因子STAT3能够通过与pGL-3-1742 promoter启动子序列结合并抑制荧光素酶的转录和表达,预测位点删除后STAT3调节作用消失;转录因子FoxP3也能够抑制pGL-3-1742 promoter质粒荧光素酶的转录和表达。与糖尿病脂肪间充质干细胞共培养后CD4+T细胞内STAT3 与 Ptn2基因启动子结合显著增强,而FoxP3与Ptpn2基因启动子结合显著减弱。结论(1)2型糖尿病脂肪间充质干细胞发生代谢性炎症,代谢功能发生改变,此外其抑炎作用减弱,促炎作用明显增强,导致CD4+T细胞发生促炎表型极化,并介导下游巨噬细胞的炎性极化,加剧代谢性炎症的传递和扩布。(2)磷酸酶PTPN2通过降低CD4+T细胞内STAT3磷酸化水平,抑制2型糖尿病脂肪间充质干细胞诱导的CD4+T细胞促炎表型极化和巨噬细胞炎性极化,进而抑制代谢性炎症的传递和扩布。(3)转录因子STAT3和FoxP3通过与Ptpn2基因启动子序列相互作用在转录水平负向调节PTPN2的表达。研究背景急性冠脉综合征是冠心病中急性发病的临床类型,也是冠心病患者的最主要死因,包括不稳定型心绞痛(UAP)、非ST段抬高型心肌梗死(NSTEMI)和ST段抬高型心肌梗死(STEMI)。在所有急性冠脉综合征的发病原因中,与斑块不稳定性增加导致的原发冠状动脉事件占大多数,斑块体积越大其易损性越高。此外斑块导致的管腔严重狭窄直接影响冠脉的血流动力学,冠脉血流储备显著下降,患者心肌缺血临床症状明显。因此,临床常依据冠脉病变的狭窄程度诊断冠心病并进行危险分层。目前通过冠状动脉影像学检查评估冠脉病变程度,其中以冠状动脉造影检查结果为金标准。但由于有创、价格昂贵、技术性强等因素,冠状动脉影像学检查目前仍限于确诊试验而非常规筛查试验。常用的筛查试验例如心电图、动态心电图、运动试验、超声心动图等并不直接反映冠脉病变程度。近年来循环生物标记物对冠心病患者冠脉病变程度的预测价值逐渐受到关注,这类标记物的确立将有助于高危人群早期筛查和干预,对急性冠脉综合征的早期防治具有重要价值。免疫细胞促炎/抑炎平衡异常造成的系统性炎症反应是促进冠脉病变发生发展的重要原因,其中以单核-巨噬细胞炎性极化为核心的固有免疫炎症反应参与急性冠脉综合征从斑块破裂到血栓形成的全过程,其炎性极化程度与病情及预后密切相关,而以辅助性T细胞(Th细胞)促炎/抑炎平衡紊乱为主要表现的适应性免疫炎症反应也极大促进急性冠脉综合征的病情。既往研究通过各类血细胞计数、比率及多种炎症因子含量变化反应免疫细胞功能并预测急性冠脉综合征病情,但这些指标无法直接特异反映免疫细胞促炎/抑炎状态,此外与冠脉病变程度的关系不够明确。我们希望筛选出一种能够反映免疫细胞状态的急性冠脉综合征病情评估生物标志物,该分子能够定位于具体细胞亚群,动态可靠地反映免疫细胞促炎/抑炎平衡,同时该分子在动脉粥样硬化病变发生发展中具有重要作用,其表达能够随动脉粥样硬化病变程度发生改变,通过检测该分子的表达率,能够对急性冠脉综合征高危人群早期预警、诊断和分型,对急性冠脉综合征的危险度进行估测与分层,并且能够评价急性冠脉综合征患者治疗反应、获益或预后。T 细胞免疫球蛋白黏蛋白分子 3(T cell immunoglobulin and mucin domain 3,Tim-3)可能是急性冠脉综合征病情评估的新型生物标志物。Tim-3在多种免疫细胞表面均有表达。目前认为Tim-3是T细胞的免疫抑制分子,介导T细胞发生免疫疲劳,在肿瘤发生发展中Tim-3表达增加介导T细胞免疫功能受限,免疫监视能力下降,促进肿瘤的发生发展和转移;而在系统性炎症疾病如急性肺损伤、实验性自身免疫性脑脊髓炎、自身免疫性肝炎中T细胞表面Tim-3表达显著下降,T细胞过度活化,机体炎症活动显著增加,增加Tim-3表达或通过配体激动Tim-3后能够显著缓解症状。Tim-3也与其他免疫细胞的功能密切相关,但多表现为免疫活化作用。近来研究发现免疫细胞Tim-3与动脉粥样硬化关系密切。在动脉粥样硬化发生过程中,多种免疫细胞表面Tim-3表达均显著上调,给予Tim-3阻断抗体处理后血管病变却显著加重,提示免疫细胞表面Tim-3表达上调为保护性因素;动脉粥样硬化患者外周血CD8+Tim-3+细胞比率增加,CD8+Tim-3+细胞通过分泌抗动脉粥样硬化的细胞因子发挥血管保护作用。由于Tim-3表达于多种免疫细胞表面,能较准确反映免疫细胞促炎/抑炎功能,且与动脉粥样硬化关系密切,我们推测免疫细胞Tim-3可能是急性冠脉综合征患者病情评估的新型生物标记物,其表达率反映急性冠脉综合征患者冠脉病变程度,对患者的危险程度进行估测分层,并能够评价急性冠脉综合征患者治疗反应、获益等,但相关内容目前尚未见报道。在本研究中我们将检测患者外周血单个核细胞亚群Tim-3表达率,并着重通过研究急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞各亚群Tim-3表达率与冠脉病变的关系及其对冠脉病变程度分层、治疗反应评价的价值探讨Tim-3作为评估急性冠脉综合征病情的新型生物标记物的意义。研究目的(1)研究急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞Tim-3表达率与临床病情及冠脉病变程度的关系,研究外周血单个核细胞Tim-3表达的相关影响因素。(2)研究急性冠脉综合征患者外周血单个核细胞Tim-3作为评估急性冠脉综合征病情的新型生物标记物的价值。研究方法(1)受试者入组:本研究方案由山东大学齐鲁医院伦理委员会审查通过,所有受试者均书面知情同意;依据AHA/ACC诊断依据初步诊断为急性冠脉综合征并拟行冠状动脉造影检查的住院患者;根据肌钙蛋白I(cTnI)检测结果进行临床诊断分组:cTnI≥30ng/L为急性心肌梗死组(AMI),cTnI<30ng/L为不稳定型心绞痛组(UAP);同时纳入部分行冠脉造影检查,冠脉最重狭窄程度<50%的患者作为对照组;排除合并有重度瓣膜病变、严重感染性疾病、肿瘤、风湿免疫系统疾病以及没有行冠脉造影的患者。(2)受试者外周血采集及单个核细胞分离:于患者行冠脉造影当日空腹采集静脉血3mL,使用紫色EDTA抗凝管采集外周血;静脉血采集后2小时内进行外周血单个核细胞的分离及固定。(3)受试者病历信息采集:于医院住院病历系统内根据患者住院号和姓名确定患者身份,并采集相关指标,包括:一般情况(年龄、性别),体格检查结果(收缩压、舒张压、心率、体重、身高),病史(高血压病史、糖尿病病史、吸烟史、饮酒史、用药史),入院实验室检查结果(总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、cTnI、CK-MB)。(4)受试者冠脉病变资料的采集:根据患者的冠脉造影手术记录和冠脉造影影像资料判读冠状动脉病变的严重程度,主要采集以下指标:冠脉各处病变的狭窄程度(用百分比表示),冠脉狭窄性病变的节段数,冠脉病变累及的血管数及具体血管,并根据公式和评分标准计算该患者冠脉病变Gensini评分,以上四种指标用于综合评判冠脉病变的严重程度。(5)外周血单个核细胞Tim-3表达率的检测:通过流式细胞学技术检测外周血单个核细胞CD4+、CD8+、CD11c+、CD14+亚群Tim-3表达率。(6)统计分析:通过单因素方差分析及协方差分析比较各组患者单个核细胞各亚群Tim-3表达率;通过简单线性相关、studentt检验及多元线性回归分析各危险因素及用药情况对Tim-3表达率的影响;通过简单线性相关、多元线性回归分析单个核细胞各亚群Tim-3表达率与冠脉病变程度的关系;通过受试者工作特征曲线(ROC曲线)分析单个核细胞各亚群Tim-3表达率对冠脉病变程度的预测价值。结果1.入组患者临床基本资料比较(1)本研究中我们依据前述纳入与排除标准,一共纳入131例患者,其中对照组29例,不稳定心绞痛组77例,急性心肌梗死组25例,三组患者在年龄及性别构成上无显著统计学差异。(2)不稳定型心绞痛组收缩压较对照组和急性心肌梗死组升高;急性心肌梗死组患者空腹血糖升高,其与不稳定心绞痛组的差异具有统计学意义;急性心肌梗死组患者高密度脂蛋白胆固醇降低,其与对照组的差异具有统计学意义;三组患者在cTnI的差异具有统计学意义,其中急性心肌梗死组的cTnI较其他两组升高;不稳定型心绞痛组患者硝酸酯类药物的使用率增加,差异较对照组相比具有统计学意义。(3)与对照组相比,不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组的冠脉狭窄最重程度增加,冠脉病变节段数和冠脉病变累及血管数增多,Gensini评分升高;与不稳定型心绞痛组相比,急性心肌梗死组冠脉病变严重程度增加。2.流式细胞学分析入组患者外周血均能通过流式细胞学检测得到CD4+、CD8+、CD11c+、CD14+细胞亚群Tim-3表达率。3.外周血单个核细胞Tim-3表达率的影响因素(1)CD4+、CD8+、CD11c+、CD14+细胞Tim-3+亚群之间存在相关性。(2)高密度脂蛋白胆固醇与CD4+细胞Tim-3表达率存在正相关(r=0.267,p<0.01),甘油三酯和年龄与CD14+细胞Tim-3表达率存在负相关(r=-0.188,p<0.05,r=-0.200,p<0.05);糖尿病病史降低CD4+及CD8+细胞Tim-3表达率;使用他汀类药物与CD4+细胞Tim-3表达率呈正相关(β=4.61,p<0.05)。4.入组患者外周血单个核细胞Tim-3表达率与临床诊断的关系(1)在控制了相关协变量后,各组患者CD4+细胞Tim-3表达率随临床诊断的加重而降低,进一步比较发现,与对照组相比,不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组CD4+细胞Tim-3表达率下降,不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组之间结果差异无统计学意义。(2)各组患者CD14+细胞Tim-3表达率随临床诊断的加重而增高,进一步比较发现,与对照组相比,不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组患者CD14+细胞Tim-3表达率增加,而不稳定型心绞痛组和急性心肌梗死组之间结果差异无统计学意义。(3)各组患者在CD8+细胞和CD11c+细胞Tim-3表达率的差异无统计学意义。5.外周血单个核细胞Tim-3表达率与冠脉病变程度的关系(1)CD4+细胞Tim-3表达率与冠脉狭窄最重程度和Gensini评分呈负相关(r=-0.193,p<0.05;r=-0.274,p<0.01),CD8+细胞 Tim-3 表达率与冠脉病变Gensini评分和心肌损伤标志物CK-MB、cTnI呈负相关(r=-0.194,p<0.05;r=-0.220,p<0.05;r=-0.262,p<0.05),CD11c+细胞 Tim-3 表达率与冠脉狭窄最重程度和Gensini评分无显著相关性,CD14+细胞比率与冠脉狭窄最重程度和cTnI 呈正相关(r=0.212,p<0.05;r=0.226,p<0.05)。(2)多元线性回归提示CD4+细胞Tim-3表达率与Gensini评分呈负相关(β=-0.28,p=0.029),CD14+细胞Tim-3表达率和糖尿病病史与Gensini评分呈正相关(β=0.26,p=0.015;β=0.358,p=0.001),控制各影响因素后CD4+细胞和CD14+细胞Tim-3表达率与Gensini评分关系依然成立,进一步分析发现CD4+Tim-3+亚群是冠脉病变的主要保护性因素,而CD14+Tim-3+亚群是冠脉病变的主要致病因素。6.外周血单个核细胞Tim-3表达率对冠脉病变程度的预测价值(1)CD4+细胞Tim-3表达率对狭窄最重程度小于70%具有预测价值,其中CD4+细胞Tim-3表达率截断值为20.65%,即当CD4+细胞Tim-3表达率超过20.65%时冠脉病变的狭窄最重程度小于70%,该截断值的检验灵敏度为50.0%,特异度为81.3%;CD4+细胞Tim-3表达率对冠脉病变最重狭窄程度小于50%和小于100%没有预测价值;CD4+细胞Tim-3表达率对冠脉病变节段数(单处或多处)及冠脉病变累及血管数(单支或多支)无预测价值。(2)CD14+细胞Tim-3表达率对冠脉病变100%狭窄具有预测价值,其中CD14+细胞Tim-3表达率截断值为15.8%,即当CD14+细胞Tim-3表达率超过15.8%时冠脉病变的狭窄最重程度达100%,该截断值的检验灵敏度为62.5%,特异度为73.4%;CD14+细胞Tim-3表达率对冠脉病变最重狭窄程度大于50%和大于70%没有预测价值:CD 14+细胞Tim-3表达率对冠脉病变节段数(单处或多处)及冠脉病变累及血管数(单支或多支)的预测价值无统计学意义。(3)CD14+Tim-3+%/CD4+Tim-3+%对冠脉最重狭窄≥50%,≥70%和 100%均具有较强的诊断价值,该比值对冠脉最重狭窄≥50%,≥70%和100%的截断值依次为0.62、0.78、0.96,即当该比值分别超过0.62、0.78和0.96时冠脉病变的狭窄最重程度分别达到或超过50%、70%和100%,该指标预测冠脉病变最重狭窄程度的灵敏度均超过60%,特异度均超过70%,CD4+Tim-3+%比值对冠脉病变节段数(单处或多处)及冠脉病变累及血管数(单支或多支)的预测价值无统计学意义。结论(1)外周血单个核细胞Tim-3是急性冠脉综合征患者病情评估的新型循环生物标记物,其中CD4+细胞Tim-3表达率和CD14+细胞Tim-3表达率随冠脉病变程度和病情严重程度发生动态改变;外周血CD4+细胞Tim-3表达率、CD14+细胞Tim-3表达率及CD14+Tim-3+/CD4+Tim-3+比值对冠脉病变最重狭窄程度具有预测价值;(2)外周血单个核细胞Tim-3受多种因素的影响,其中高密度脂蛋白胆固醇、甘油三酯、他汀类药物、年龄、糖尿病病史能够影响外周血单个核细胞Tim-3表达率。