新疆部分地区牛、羊源肠外致病性大肠杆菌分离鉴定、分子分型及耐药性研究

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目的:大肠杆菌(Escherichia coli,E.coli)是危害世界养殖业三大细菌病之一,是一种重要的人畜共患病原体。由E.coli引起的感染和流行是一个世界性的问题。新疆是牛羊养殖大省,牛羊E.coli病时有发生,不仅给畜牧业生产造成重大的经济损失,还会对公共健康构成潜在威胁。为了了解近年来新疆部分地区牛、羊肠外致病性大肠杆菌(Extraintestinal Pathogenic Escherichia coli,ExPEC)的流行情况和生物学特征,从疑似由E.coli引起死亡的牛和绵羊的病料中分离病原,对其进行系统发育分群、血清型和多位点序列分型(Multilocus Sequence Typing,MLST)以及携带的毒力因子和生物被膜(Biofilm,BF)的形成能力分析,对耐药表型及耐药基因的携带情况以及耐药质粒的传递性进行了研究。方法:(1)无菌采集2015-2019年期间新疆部分地区疑似E.coli病患病牛和绵羊的肝脏、脾脏、肺脏、心脏、脑和淋巴结等组织,采用常规细菌分离鉴定技术结合细菌生化鉴定系统以及16S rRNA扩增鉴定病原,通过小鼠感染试验确定其致病性,采用PCR法对ExPEC特殊毒力因子进行检测,采用多重PCR的方法测定分离株的系统发育群,玻片凝集法确定血清型及特定基因测序法鉴定MLST。(2)采用PCR基因扩增法分析分离菌携带毒力因子的情况,96孔微量板法分析其产生BF的能力及形成的最佳时间。(3)采用纸片法对分离株进行26种抗生素药物的耐药表型的检测,分析其常见的耐药基因的携带情况。从分离株中提取携带β-内酰胺类基因的耐药质粒,转入空白E.coli DH5α中,进行质粒耐药传递特性的检测和分析。结果:(1)从新疆部分地区2015-2019年间疑似E.coli感染的患病牛和绵羊的肝脏、脾脏、肺脏、心脏、脑和淋巴结等组织中分离鉴定132株E.coli,具有不同程度的致病性,通过特殊基因检测确定为ExPEC;依据携带毒力因子特点,分离株分属7个系统进化发育群,其中A和B1群为主要优势群;共鉴定出22个不同的血清群,以O101(26株),O154(14株)和O65(8株)为主;MLST将分离株分为15个不同的ST型,ST10是最普遍的序列类型,占分离株的18.4%(7/38),依次是ST23,为13.2%(5/38),ST457,为10.5%(4/38)。(2)在分离株中curli菌毛crl基因检出率最高,达到97.4%,其次是溶血素hlyE,检出率为94.69%;系统分群B2群携带的毒力因子基因相对较多;132株分离株中有105株(79.5%)细菌具有产生BF的能力,其中有15株(11.4%)为强成膜株,28株(21.2%)为中成膜株和62株(47%)为弱成膜株。BF从6 h开始形成,36 h左右时BF的形态趋于完整直至顶峰,之后BF网状结构逐渐解离,72h左右时BF的结构消散。(3)药敏试验结果表明,对β-内酰胺类、氨基糖苷类、四环素类和喹诺酮类药物耐药率普遍较高,最常见对头孢拉定(81.2%),链霉素(76.9%),庆大霉素(71.6%)和恩诺沙星(64.6%)的耐药率较高。氨基糖苷类耐药基因aph(3’)-Ia检出率最高,为62.12%;β-内酰胺类中blaTEM检出率最高,为72.73%;四环素类中tetA的检出率最高,为75%;喹诺酮类gyrA检出率最高,为98.28%,磺胺类sul2的检出率最高为75%;分离株中最多携带15种耐药基因,最少携带2种。结论:新疆部分地区牛、羊源ExPEC多属于A和B1群,血清型和多位点序列分型丰富,分离株携带丰富的毒力因子和耐药基因,耐药率较高且多重耐药率普遍,多数能产生明显的BF。这些情况使新疆地区E.coli病的防治愈加困难。
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