论文部分内容阅读
2006年夏季以来,我国南方高温高湿地区猪场爆发了一种以高热、高发病率、高死亡率为特征的高热综合症,给我国养猪业造成了极大的经济损失。本研究就此次高热症疫情流行病学进行初步分析,在2006年9月-2008年1月间,从浙江等地11个地区共收集152份患病猪病料,包括肺、脾、淋巴结、血清等样本,采用(RT)-PCR技术对所采集病料进行病原诊断,检测病原包括猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪伪狂犬病病毒(PRV)、猪流感病毒(SIV)等5个病原。结果显示,以PRRSV的感染最为严重,阳性率达50.7％;其次为CSFV,阳性率为13.8％;PCV2排第三位,阳性率为8.6％;PRV、SIV阳性率最低,分别为2.6％、0.7％。
以RT-PCR检测PRRSV阳性的病料上清接种Marc-145细胞分离PRRSV病毒,利用PRRSV特异性N基因引物鉴定分离毒,并测定毒株效价(TCID50)。结果表明,共分离到9株PRRSV,分别命名为FY060915、SH061130、HZ061226、HZ070105、NB070319、XS070425、ZS070921、SX071226、FY080108,9株毒株均可扩增出PRRSV特异性N基因片段。除SH061130、HZ061226、FY080108这3株病毒于接种后第二代出现细胞病变以外,其余6株病毒均于接种后第一代即出现典型细胞病变;第二代分离毒的TCID50分别为104-4.6/0.1ml、10-2.7/0.1ml、10-4.3/0.1ml、104-4.9/0.1ml、10-6.8/0.1ml、10-4.8/0.1ml、10-4.6]0.1ml、10-6.9/0.1ml、10-3.6/0.1ml,且9株毒株在Marc-145细胞上的增殖能力存在差异。
采用RT-PCR技术扩增PRRSV分离株Nsp2和ORF5基因,分别克隆到pMD18-T载体后进行序列测定,将克隆到的Nsp2和ORF5基因与GenBank发表的相应基因序列进行比较分析,并绘制遗传进化树。结果显示,Nsp2基因变异较大,9株PRRSV分离株中,6株(FY060915、HZ061226、HZ070105、NB070319、ZS070921、FY080108)具有高致病性PRRSV Nsp2基因存在30个氨基酸缺失的特征,即481位1个保守的亮氨酸(L)缺失和532.560位连续29个“SRPVTPLSEPIPVPAPRRKFQQVKRLSSA”氨基酸缺失;2株(SH061130、XS070425)仅在481位缺失1个亮氨酸;1株(SX071226)Nsp2基因无缺失现象;SX071226株与美国疫苗株MLV同源性最高,遗传距离较近;另外8株与JXA1等高致病性PRRSV同源性较高,遗传距离较近:GP5区分疫苗株的137位氨基酸,除SX071226为丙氨酸(A)Pb,其余8株为丝氨酸(S)。研究结果表明,SX071226毒株来源于疫苗株,其余8均为野毒株。
选取两株代表性毒株XS070425、ZS070921以及病料组织悬液采用滴鼻方式人工感染健康仔猪,进行致病性试验。研究结果表明,感染猪均出现不同程度的体温升高、精神萎靡、食欲不振以及典型的“兰耳”症状,但均不致死;不同的毒株导致的病毒血症持续时间存在一定的差异,XS070425毒株感染的病毒血症持续23天左右,而具备高致病性PRRSV特征的ZS070921攻毒组病毒血症持续34天左右;qPCR检测结果表明,血清中PRRSV含量于感染后7-11天达到峰值(1.01×108-4.0×109 copies/ml),并且ZS070921攻毒组病毒含量明显高于XS070425攻毒组;眼观及病理组织学结果显示,感染猪主要表现为肺脏不同程度水肿、淤血、气肿和出血,腹股沟淋巴结和肺门淋巴结水肿、出血较为严重等大体病变,以及肺泡减少、间质增宽、间质中淋巴细胞浸润、部分区域发生代偿性肺气肿,淋巴结出血、水肿以及肝细胞颗粒变性等显微病变。另外,病料组织悬液攻毒组试验,在感染后的血清及组织中检测到了低拷贝的PCV2病毒核酸,研究发现PCV2可促进PRRSV的复制,加重了高热症疫情。