利用全基因组测序技术筛选影响鸭羽色、喙色及蹼色的候选基因及其关联验证

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羽色、喙色及蹼色是鸭重要的表型标记。为了寻找影响鸭羽、喙、蹼色变异的基因,本研究以课题组建立的杂交鸭F2代资源群体(1534个个体)为研究对象,先构建不同表型个体DNA池样本进行基因组简并测序(Rad-seq)、后采用不同表型样本全基因组重测序的方法,对影响鸭色素性状的候选基因进行筛选,并对筛选出的候选基因中的两个基因CADPS及PTPRG与鸭羽、喙及蹼色进行了关联研究,主要研究结果如下:1.构建不同表型个体DNA池样本、采取简并基因组测序法对F2代群体鸭两种极端表型(黑羽黑喙黑蹼及白羽黄喙黄蹼)个体DNA样本分别进行测序,然后进行序列比对,经过滤共得到72个分别在黑羽样本或白羽样本中纯合的SNP位点,其中有12个SNP位点定位于不同功能基因中。对其中导致酶切位点改变的2个SNP(g.593704G>A,g.625503T>C)位点,利用PCR-RFLP方法对F2代资源群体中部分个体(561个)进行基因型鉴定并采用列联表独立性检验法对SNP位点与羽色、喙色及蹼色表型进行关联研究,结果发现这2个SNP与鸭羽色、喙色和蹼色均无显著关联(P>0.05)。2.在F2代资源群中筛选出4个全同胞家系,在每个家系中按黑羽、黑喙、黑蹼,白羽、黄喙、黄蹼以及黑羽、黑喙、黄蹼将家系个体分成三类,抽提各个体DNA、以家系为单位按表型混合成10个样品。对这些样本DNA进行基因组重测序,获得序列后从中筛选突变频率大于0.9(AF>0.9)且覆盖深度在4-1000之间(4<DP<1000)的SNP,并进一步筛选在所有家系中不同表型样本中均存在的SNP,选取这些SNP上下游3Kb以内的基因作为与羽色性状相关的候选基因,一共获得256个候选基因。3.对上述获得的256个候选基因进行GO注释,研究发现与黑羽表型相关的基因主要与细胞内细胞器、特别是膜结合细胞器有关,推测这些基因可能与黑色素细胞中特有的细胞器黑色小体的发育等有关。与白羽表型相关的候选基因主要涉及与突触有关的突触密度、定型和及突触膜以及与细胞内囊泡有关的膜结合囊泡、囊泡转运及胞泌囊泡,推测这些基因可能与黑色素小体在黑色素细胞内及黑色细胞与角质细胞间转运有关。4.上述256个候选基因中有4个基因在群体中出现较多变异位点(10个SNP以上),分别为FOXP1,CADPS,PTPRG和FMNL2基因,本研究利用F2资源群体对CADPS,PTPRG两个基因与目标性状进行了关联研究。在CADPS基因中共检测到4个能引起限制性内切酶酶切位点改变的SNP位点,分别为g.69222T>C,g.124754C>T,g.128198G>A,g.129067A>T,使用PCR-RFLP方法鉴定F2资源群体各个体基因型后,采用列联表独立性检验法分析基因型与鸭羽色、喙色及蹼色表型进行关联分析,结果表明:这4个SNP位点均与鸭羽色、喙色、蹼色均有极显著关联(P<0.01)。5.在PTPRG基因中共检测到3个能引起限制性内切酶酶切位点改变的SNP位点,分别为g.351484T>C,g.347121C>T,g.351418C>T,使用与研究CADPS基因相同的研究方案研究该基因与目标性状的关联,结果表明这3个SNP位点均与鸭羽色、喙色、蹼色有极显著关联(P<0.01)。6.使用RT-PCR方法,分别对CADPS、PTPRG基因在鸭羽毛毛球组织的表达量进行了检测,结果发现,CADPS基因在黑羽鸭中的表达量显著高于麻羽与白羽(P<0.05),而PTPRG基因在黑羽鸭和白羽鸭中的表达量没有显著差异(P>0.05)。综上所述:CADPS基因变异可能与鸭羽色性状相关,推测其参与调控了鸭黑色素的转运过程。CADPS及PTPRG可作分子标记在鸭羽色、喙色及蹼色育种中使用。
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