骨质疏松是以骨量减少,骨的微观结构退化为特征,致使骨的脆性增加易于发生骨折的一种全身性骨骼疾病。近年来骨质疏松发病率的逐年增高引起全世界的广泛关注。绝经后妇女卵巢功能低下,雌激素分泌减少,骨转换亢进,骨吸收大于骨形成,造成骨丢失,产生骨质疏松。由于雌激素缺乏是绝经后骨质疏松的首要病因,故雌激素替代疗法是临床上的一线疗法。激素替代疗法虽然能够阻止绝经后妇女骨量的丢失,并且提高骨密度,但长期使用有促子宫内膜增生、增加冠心病、脑卒中、肺栓塞、乳腺癌等发生率的危险。由于植物雌激素有雌激素样作用而没有雌激素的副作用,因此人们试图用植物雌激素,如大豆异黄酮等来防治骨质疏松。异黄酮由于在结构上与雌激素非常相似,所以其具有类雌激素或抗类雌激素的生理作用,它能够模拟天然的雌激素,与雌激素受体竞争性结合,调节其活性。因此黄酮类化合物对激素依赖性的癌症（如前列腺癌、子宫癌、乳腺癌等）的防治特别有效,并能延缓或减轻中老年妇女绝经期的各种症状。植物雌激素具有双重生物活性,既能发挥促雌激素作用又能发挥抗雌激素作用,但其机理还不完全清楚。部分体内实验显示其生物活性是根据个体内源性雌激素含量来调节的。长期临床试验证明:异黄酮对低雌激素水平者,表现为弱的雌激素样作用,可防治一些和雌激素水平下降有关的疾病,如更年期综合症、骨质疏松、高脂血症等;对于高雌激素水平者,表现为抗雌激素活性,可防治乳腺癌、子宫内膜癌等,可见其对机体具有双向调节平衡功能。摄入大量的大豆制品能使雌激素循环受抑,并影响绝经前妇女的月经周期。三羟异黄酮作为一种植物雌激素,其结构与雌激素相似,通过模拟雌激素作用可调节骨代谢,促进成骨细胞增殖和骨形成,并减少去除卵巢后骨量的丢失,产生防治骨质疏松的作用。异黄酮防治骨质疏松的作用机制仍未完全清楚,但可明确的是ER是作用的关键因素。异黄酮通过细胞膜进入细胞核,与核ER受体结合,改变其构型,形成配基受体复合物二聚体,这种配基诱导的复合物与共调节蛋白（辅激活子或辅抑制子）结合,再与特定的DNA序列和亚序列结合,发生组织或细胞特异性的基因表达。异黄酮无论是对骨、胆固醇代谢所表现的雌激素激动剂的效应还是在子宫及乳腺组织中所表现的拮抗剂的作用都与ER高亲和力的相互作用有关。雌激素受体有两种亚型,分别是ERα和ERβ,两种亚型在人体许多组织和细胞都有分布,ERα在尿道、乳腺中占主导地位,而ERβ在骨骼、心血管、免疫系统、中枢神经系统中高表达,异黄酮和ERα、ERβ结合,在不同的组织或在不同的生理条件下产生雌激素样作用或抗雌激素样作用。其组织选择性作用的发挥可由三种相互作用的机制来解释:靶组织中两种ER亚型表达的差异;不同配体结合引起的ER构型变化的差异;共调节蛋白表达水平的差异及与ER结合的种类数量的不同。有文献报道,骨骼中,异黄酮在生理水平则选择性作用于ERβ,与其亲合力为ERα的20倍。异黄酮促进成骨细胞株MC3T3-E1细胞的增殖作用可能与ERβ激动有关。锌是动物机体必需的微量元素,除了参与生长发育、生殖和免疫等多种生理反应外,在骨骼代谢和相关功能基因表达方面也发挥重要作用。Relea等认为锌具有稳定肥大细胞和抑制内源性肝素颗粒释放的作用,而骨源性肝素与骨质疏松病理过程有关。锌还可以协同细胞因子、雌激素等,调节骨细胞的代谢。Aitken通过对股骨的活检测定骨锌的含量,发现锌与股骨密度密切相关。Fushimi等报道糖尿病鼠血锌比对照组低,24 h尿锌排出量为对照组的3倍,通过检测分析发现尿锌增加与血浆、肝、肾内锌下降无关,而与骨组织锌含量减少有显著关系。总之,骨质疏松是一种复杂的病变过程,而锌作为微量元素,既是骨的组分,又参与骨的代谢过程,临床研究发现血清锌和尿锌与骨质疏松有相关性。锌能够促进成骨细胞从G0/G1期向S期转化,加速细胞进入DNA合成期,从而促进DNA合成及细胞增殖。实验目的:以成骨细胞MC3T3-E1为研究对象,研究不同剂量三羟异黄酮和锌单独、联合作用对MC3T3-E1细胞增殖的影响,并通过研究细胞中碱性磷酸酶（ALP）、骨形成蛋白-2（BMP-2）表达的变化,探讨锌和三羟异黄酮对骨质疏松的防治作用及其作用机制。实验方法:细胞使用α-MEM培养基（含10 %灭活的胎牛血清、100 U/mL青霉素和100 mg/L链霉素）,置于37℃、5 %的CO2培养箱中常规培养,取对数生长期细胞用于实验。根据实验目的,将细胞分为以下六组: （1）正常对照组:不加任何处理因素常规培养;（2）溶剂对照组:培养液中加入DMSO,体积比为0.1 %; （3）阳性对照（E2）组:在培养液中加入E2,使终浓度为1×10-9 mol/L;（4） Zn组:在培养液中加入Zn,终浓度分别为1×10-6 mol/L、1×10-5 mol/L、1×10^-4 mol/L;（5） GS组:在培养液中加入GS,终浓度分别为1×10^-7mol/L、1×10^-6 mol/L、1×10^-5) mol/L、1×10^-4 mol/L;（6） GS+ Zn组:在GS组各浓度中分别加入终浓度为1×10^-5) mol/L的Zn。将细胞接种于96孔培养板（2×10³个/孔）,培养24h待细胞贴壁后,按实验分组于每孔加入不同浓度的各种受试物（总体积200μl/孔）,每一剂量组设8个复孔,分别培养24h、48h、72h、96h,通过MTT比色实验,检测处理因素对MC3T3-E1细胞增殖的影响。将细胞接种于6孔培养板（1×10⁴个/孔）,24h后换含不同浓度受试物的α-MEM培养液。孵育72h后收集所有细胞,用考马斯亮蓝法测定蛋白浓度。按ALP试剂盒操作步骤检测MC3T3-E1细胞中ALP的含量。应用Western blot法检测三羟异黄酮与锌联合作用前后,成骨细胞中BMP-2蛋白的表达水平。实验结果:1、三羟异黄酮单独作用于MC3T3-E1细胞,其增殖率随着三羟异黄酮浓度的增加和作用时间的延长而升高,当1×10^-5 mol/L的三羟异黄酮作用细胞96h时,其增殖率是140.7±21.1%;当Zn浓度为1×10^-5 mol/L时作用细胞96h,其增殖率最大,为135.9±20.9%;而当1×10^-5 mol/L的三羟异黄酮协同1×10^-5 mol/L的锌作用细胞96 h,其细胞增殖率大于两者单独作用,为160.8±20.9 %。2、各干预因素处理MC3T3-E1细胞72 h后,ALP的活性随着GS浓度的增加而增强。Gs浓度为1×10^-5mol/L时与1×10^-5mol/L的Zn单独作用细胞时,ALP活性分别是对照组的1.5、1.4倍,而当其协同作用细胞时,ALP活性是对照组的1.7倍。3、GS和Zn作用于MC3T3-E1细胞72 h后,细胞中BMP-2蛋白的表达随着Gs浓度的增加而增强;Gs和Zn协同作用时BMP-2蛋白的表达比单独作用时明显增强。4、三羟异黄酮和锌联合作用后,对MC3T3-E1细胞的增殖、ALP活性的增强、BMP-2表达的增加作用均较各自单独作用时更为明显（P < 0.05）。实验结论:三羟异黄酮与锌协同作用表现出雌激素效应,可通过促进骨形成蛋白的合成从而促进成骨细胞的增殖、增加骨量。因此,在预防和治疗骨质疏松中可能发挥积极的作用。