目的：建立基于蓝白筛选技术进行评估CRISPR/Cas9酶活性的方法；使用此方法评估CRISPR/Cas9基因编辑的靶效应和脱靶效应。　　方法：人工构建基于蓝白斑筛选的含有CRISPR/Cas9靶序列的报告质粒，通过菌落产生的蓝变白与白变蓝两种不同变化，建立在原核水平检测CRISPR/Cas9靶效应和脱靶效应的有效方法体系。在蓝变白实验中，将包括与gRNA完全互补的靶序列，PAM位点突变的靶序列，PAM位点旁1到19位点碱基连续突变的靶序列等一系列基因片段亚克隆至PMD-19T质粒的lacZ基因起始密码子后，并保持基因阅读框不发生移码,其转入大肠杆菌后对应的菌落颜色为蓝色。再将相应的gRNA克隆至原核CRISPR/Cas9质粒上，共同转化构建成功的CRISPR/Cas9和含有对应靶点的PMD-19T质粒将会导致菌落颜色发生变化。我们初步通过这种颜色的变化来直观地判断是否发生CRISPR/Cas9剪切作用，后续通过溶菌实验以及荧光定量PCR实验来计算剪切量的多少，从而有效地评估CRISPR/Cas9剪切的靶效应和脱靶效应。在白变蓝的实验中，建立了三种用于核酸酶活性检测的含有双重复片段载体。将双重复片段载体与蓝白斑筛选相结合，待测靶序列和重复片段均位于α-多肽基因编码序列之内，并且预先设计使编码框架发生移码效果，这样的载体自身转化得到的大肠杆菌表现为白色。同时，载体构建时设计的重复片段之间发生重组反应后能使基因阅读框架恢复为不移码的状态。这样，当共转化CRISPR/Cas9使靶序列发生剪切后,导致在大肠杆菌内发生重复片段的重新组合，可形成一部分蓝色的菌落斑。蓝色菌落斑的形成，验证了蓝变白实验中CRISPR/Cas9剪切的发生。蓝色菌落斑的多少，与核酸酶的剪切活力的大小相关，由此确定CRISPR/Cas9是否对靶序列发生了剪切以及剪切量的多少。同样地，我们也对重复片段中间的靶序列的不同位点进行单碱基突变，通过观察共转后生成的蓝菌和白菌的不同的比例，来研究CRISPR/Cas9剪切的靶效应和脱靶效应。靶序列与gRNA完全互补时，检测靶效应；靶序列与gRNA不完全互补时，则该技术用于检测脱靶效应。　　结果：蓝变白实验中，原核系统中均可实现gRNA与靶点序列碱基完全互补时，CRISPR/Cas9剪切靶点序列后菌落呈白色；当gRNA与靶点序列碱基完全不互补时，剪切后菌落呈蓝色；当检测连续错配单碱基的靶序列，所产生菌落则为不同程度的蓝色菌落，总体趋势为：突变位点越靠近PAM位点，在CRISPR/Cas9剪切后，则菌落的蓝色越深；越远离PAM位点，菌落蓝色越淡甚至趋于白色。后续通过溶菌实验和荧光定量PCR对CRISPR/Cas9剪切后的菌落进行定量分析同样解释了此现象，再次确定CRISPR/Cas9的剪切效率非百分之百，采用本方法成功对不同条件下CRISPR/Cas9剪切的靶效应和脱靶效应进行定量。剪切后的菌落蓝色越深，表明被CRISPR/Cas9剪切的靶序列越少，脱靶效应越低；剪切后的菌落蓝色越浅，则被剪切的靶序列越多，脱靶效应越高。在白变蓝实验中，构建的双重复片段载体的报告质粒使其LacZ阅读框移码，得到的大肠杆菌表现为白色。当待测靶序列受到CRISPR/Cas9的编辑时，通过实验的预先设计使菌落再次变为蓝色。当突变重复片段之间靶点的单碱基时，突变不同的位点对生成的蓝白菌的比例也有影响,总体趋势为gRNA与靶点序列碱基完全互补时，重复片段修复的效率最高；当对靶序列单碱基突变后，修复效率大大降低，但也有个别位点不受突变的影响。并且不同的双重复片段载体修复的效率不同，HBV病毒重复片段和含有噬菌体LoxP重复片段的载体效率较人类的EGFR重复片段高。　　结论：构建的基于蓝白筛选来评估CRISPR/Cas9基因编辑靶效应和脱靶效应的方法具有较高的敏感性。该方法直接明了，快速的检测出CRISPR/Cas9的酶活性大小且省时省力，不仅可用于筛选核酸酶的合适与非合适靶序列，还可以用于筛选确定靶序列的高效的基因工程酶。这两种方法可用于脱靶效应的评估，为基因编辑技术应用于人类疾病的基因治疗提供了技术保障。