鸭养殖、屠宰环节中产气荚膜梭菌的流行特点及遗传进化关系

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产气荚膜梭菌(C.perfringens)是重要的人畜共患食源性致病菌之一,在家禽养殖场中广泛存在,引发家禽的坏死性肠炎(NE),给养殖场带来巨大的经济损失;还可污染禽产品,危及食品安全,导致人类的食物中毒。禽产品的产气荚膜梭菌污染来自屠宰和产品加工等环节,存在沿食物链传播给人类的风险。中国是养鸭大国,也是鸭产品消费大国。探究产气荚膜梭菌沿鸭养殖链的流行特点和传播规律,以及在不同养殖模式下从养殖阶段到屠宰阶段的流行分布和演化规律,不仅为防控产气荚膜梭菌在鸭养殖场的流行和传播提供参考,还为控制产气荚膜梭菌在屠宰场和鸭产品的污染提供科学依据,降低产气荚膜梭菌引起食源性疾病的潜在风险。2020年6月份至11月份期间,本研究在山东省一家大型鸭养殖企业,沿其养殖链调查了产气荚膜梭菌从种鸭场到商品代肉鸭场的流行情况、毒素分型、耐药情况和遗传多样性,并在此基础上采用全基因组测序(WGS)技术研究了种鸭场流行菌株的基因组特征。为了探究不同养殖模式下鸭养殖屠宰链中产气荚膜梭菌的遗传多样性和亲缘关系,根据耐药表型、宿主来源、养殖及屠宰阶段,从发酵床养殖模式的养殖屠宰链中筛选出79株分离菌进行多位点序列分型(MLST),并与相同饲养背景下(种源、饲料和免疫一致)地面散养模式的养殖屠宰链分离菌株进行比较,探究不同养殖模式对产气荚膜梭菌流行的影响以及产气荚膜梭菌沿养殖屠宰链的污染情况和演化规律。养殖链的研究结果显示,855份样品中有45.26%的样品被鉴定为产气荚膜梭菌阳性,种鸭场、孵化场和商品代肉鸭场的阳性率分别为84.52%、26.51%和59.79%。孵化场中,健康鸭胚的肠道、卵黄囊、蛋白、壳内膜和尿囊液的样品阳性率分别为30.77%、1.61%、3.77%、9.68%和6.25%;初生雏鸭的泄殖腔样品阳性率为60.00%;死胚肠道样品的阳性率为27.40%,且污染产气荚膜梭菌的数量较多。不仅从同一批不同孵育期的鸭胚内分离到产气荚膜梭菌,还发现随胚胎发育,鸭胚肠道中产气荚膜梭菌的数量在逐渐增加。本研究共分离到617株产气荚膜梭菌,其中94.81%的菌株为A型,4.05%的菌株为F型,剩余菌株为G型。药敏试验结果显示,62.50%的菌株具有多重耐药性。MLST结果显示,从种鸭场到商品代肉鸭场的66株代表性菌株被鉴定为60个序列型(STs),69.70%的菌株形成了10个克隆复合体(CCs)。CC2菌株最为流行(15.15%,10/66),是种鸭场的优势菌,占种鸭场分析菌株的58.82%(10/17),而商品代肉鸭场菌株具有丰富的遗传多样性(STs的辛普森多样性指数为0.9565)。部分种鸭场菌株和孵化场菌株分布在同一ST或CC,表明鸭胚中的感染菌株可能来自孵化场环境或种鸭场,并存在垂直传播的可能。系统发育树的结果显示,同一养殖场分离菌株的进化关系更为相近。不同种鸭场菌株的MLST结果显示,同一种鸭场的多数菌株分布在同一ST或CC,菌株间亲缘关系密切。淄博和聊城地区种鸭场流行菌株的WGS结果显示,流行的菌株携带多种毒力基因和不同的抗生素耐药基因;基于MLST的种鸭场菌株亲缘关系与基于核心基因组单核苷酸多态性(SNP)系统发育树的种鸭场菌株亲缘关系大部分是一致的。发酵床养殖屠宰链菌株的MLST结果显示,79株代表性菌株被鉴定为71个STs,37.97%的菌株形成了8个CCs。部分养殖和屠宰环节的菌株分布在同一ST或CC,表明养殖阶段的产气荚膜梭菌可能随生产流程污染屠宰场的胴体及产品;养殖场中部分泄殖腔分离菌株与环境分离菌株关系密切;屠宰场中从加工设备分离的菌株与胴体及产品分离菌株关系密切。不同养殖模式下养殖屠宰链菌株的MLST结果显示,种源和饲料相同,但不同养殖模式下鸭群产气荚膜梭菌菌株的STs差异较大,表明不同的养殖模式会改变产气荚膜梭菌的遗传多样性。前后进入同一屠宰场宰杀的不同批次鸭群,其胴体和产品分离菌株分布在同一CC,表明前后批次的鸭胴体及产品之间可能存在产气荚膜梭菌的交叉污染。综上所述,鸭养殖屠宰链中流行的产气荚膜梭菌主要为A型,并首次从鸭场中分离到G型菌。62.50%的菌株具有多重耐药性。部分鸭胚在孵化期已感染产气荚膜梭菌,感染菌株应来源于孵化场或种鸭场,存在垂直传播的可能。种鸭场中的产气荚膜梭菌经过长期竞争演化形成了优势基因型。基于MLST的种鸭场菌株亲缘关系与基于核心基因组SNP系统发育树的种鸭场菌株亲缘关系大部分是一致的。除种源和饲料外,养殖模式显著影响产气荚膜梭菌的遗传多样性。屠宰场中前后批次宰杀的鸭胴体及产品之间存在产气荚膜梭菌的交叉污染。产气荚膜梭菌沿养殖链的污染和传播,在养殖、屠宰和产品加工过程中的交叉污染,菌株广泛的多重耐药性以及netB、cpe阳性菌株的存在,给养殖场、屠宰场和公共卫生带来潜在威胁。
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