第一章根尖周感染的根管内细菌多样性及系统发育分析　　 研究目的：　　 通过16S rRNA基因克隆文库技术和限制性内切酶PCR-RFLP指纹图谱分析慢性根尖周炎初次感染和根管治疗后持续感染根管内细菌群落的组成情况，了解根管内细菌群落构成的多样性特征。　　 材料方法：　　 收集慢性根尖周炎初次感染和根管治疗后持续感染病例，提取细菌总DNA，采用通用引物PCR扩增细菌的16S rRNA基因，构建克隆文库，通过HaeⅢ限制性内切酶对细菌16S rRNA基因文库中的克隆进行PCR-RFLP限制性酶切片段长度多样性分析，将所有阳性克隆分为若干个可操作分类单元(OTU)，选取代表克隆测序并构建系统发育树。　　 结果：　　 构建了三个慢性根尖周炎初次感染和两个根管治疗后持续感染的16S rRNA基因克隆文库。　　 对于根管初次感染的16S rRNA基因克隆文库，经PCR-RFLP图谱分析后代表测序的251个克隆中，共获得50类细菌，归属于5个细菌类群的24个细菌属别，其中26类(52％)为未获培养的细菌类别，有2类细菌为以前研究中未报道过的新类别。厚壁菌门(42％)和拟杆菌门(34％)的细菌种类最多。细菌分布具有个体差异性，主要优势菌包括普氏菌、牙龈卟啉单胞菌、具核梭杆菌、Solobacterium moorei、月形单胞菌、小杆菌、弯曲杆菌和消化链球菌。　　 对于根管持续感染的16S rRNA基因克隆文库，经PCR-RFLP图谱分析后代表测序的179个克隆中，共获得30类细菌，细菌种类和数量较初次感染减少，菌群构成也与初次感染不同，归属于5个细菌类群的11个细菌属别，其中14类(46.7％)为未获培养的细菌类别，有1类细菌为以前研究中未报道过的新类别。螺旋体门(33.3％)和拟杆菌门(26.7％)的细菌种类最多。细菌分布具有个体差异性，主要优势菌包括密螺旋体、牙龈卟啉单胞菌、普氏菌、大肠杆菌和韦荣球菌，其他检出的细菌还包括产线菌，具核梭杆菌，牙龈二氧化碳嗜纤维菌，纤毛菌和奈瑟氏菌。　　 结论：　　 慢性根尖周炎初次感染和根管治疗后持续感染是由多种厌氧菌组成的混合感染，具有丰富的菌群多样性特征。未获培养类别的细菌组成了根尖周初次感染和持续感染的主要微生物群落。根管初次感染与持续感染的菌群构成和数量均有所区别。　　 第二章根管治疗后持续感染的微生物定植模式分析　　 研究目的：　　 采用组织形态学和电镜观察的方法了解根管治疗失败后持续感染根管微生物的组织结构和定植模式，为制定根尖周持续感染的有效治疗策略提供实验依据。　　 材料方法：　　 收集16例根管治疗失败后的难治性根尖周炎病例，采用显微根尖手术切除根尖标本。6例根尖标本通过组织学染色观察根尖周组织的组织学状态和微生物的形态及其在根尖的定植情况。5例根尖标本纵向劈开后在扫描电镜下分别观察牙本质面和牙根表面的细菌生物膜形态和分布。5例根尖标本在透射电镜下观察根管生物膜的形态和分布。　　 结果：　　 (1)6例进行组织学染色的根尖标本中，有5例可观察到菌斑附着于根管壁表面，并沿牙本质小管侵入到牙本质深层，浸入深度由100μm至500μm不等。6例标本的根尖周组织均形成了根尖囊肿，有1例标本根尖囊肿的囊腔内有异物颗粒形成的结晶体，另有1例标本在根尖囊壁中出现胆固醇晶体沉积，表现为狭长的针形裂隙。　　 (2)根管内壁牙本质面和根尖牙骨质面在扫描电镜下均可观察到菌斑生物膜结构，胶原纤维网形成支架结构，密集的细菌群落镶嵌于胶原纤维网支架之中，被结构致密的胞外多糖基质覆盖包裹，构成生物膜。细菌组成以球菌和杆菌为主。　　 (3)根尖标本横断面切片在透射电镜下可观察到根管充填物与根管壁之间形成的不规则间隙区内有大量球菌包绕呈团块状，部分细菌分解崩裂导致胞壁不完整。　　 结论：　　 微生物在根管治疗后持续感染的根管内牙本质面和牙根外牙骨质面以菌斑生物膜的方式定植，并可侵入牙本质小管达500μm，是造成根管治疗失败的重要原因。胆固醇晶体和根管内异物是导致根管治疗失败的非微生物因素。　　 第三章光活化消毒控制根尖周感染根管内细菌的实时定量检测　　 研究目的：　　 采用real-time PCR的定量方法评价光活化消毒技术处理初次感染和再次感染根管内菌斑生物膜的抗菌作用，为进一步提高根管治疗成功率提供新的根管消毒方法。　　 材料方法：　　 收集15例慢性根尖周炎初次感染和8例根管治疗后持续感染病例，去除坏死牙髓组织或根管充填物后，分别进行根管治疗前、根管机械化学预备后以及光活化消毒处理后根管内样本的采集，提取细菌总DNA，采用real-time PCR定量检测根管内细菌的总量，比较各组之间细菌总量的差别。　　 结果：　　 治疗前初次感染的根管内细菌总数较持续感染的根管内细菌总数多(P=0.001)。对于初次感染病例，根管内细菌总数治疗前为2.40×106，经根管机械化学预备后降至1.78×104(降低99.26％)，光活化消毒后降至7.41×103(降低99.69％)。对于持续感染病例，根管内细菌总数治疗前为2.95×105，经根管机械化学预备后降至5.13×103(降低98.26％)，光活化消毒后降至1.66×103(降低99.44％)。经双因素方差分析比较，根管机械化学预备和光活化消毒后，细菌总量较治疗前均有明显减少(P=0.000)，光活化消毒可进一步减少根管机械化学预备后根管内的细菌总量，二者联合应用的灭菌效果优于单纯使用根管机械化学预备(P=0.048)。　　 结论：　　 初次感染根管内细菌总数较再次感染多，光活化消毒可进一步减少根管机械化学预备后根管内的细菌总量，二者联合应用的灭菌效果优于单纯使用根管机械化学预备，可作为根管治疗的辅助方法。