子宫内膜癌(endometrial carcinoma, EC)是最常见的妇科恶性肿瘤之一,严重威胁妇女健康。近年由于环境、平均寿命延长、激素替代疗法应用等各种因素的影响,其发病率逐年上升。美国癌症协会统计在2012年全球大概有47130例新发子宫内膜癌患者,已经跃居发达国家女性生殖道恶性肿瘤首位。尽管目前对子宫内膜癌的治疗方法和技术不断发展,但对晚期和复发的子宫内膜癌的治疗仍为棘手。进一步研究和寻找子宫内膜癌的新的治疗手段尤为重要。国内外研究证实肿瘤发生发展是一个复杂的分子调控失控过程,与抑癌基失活、癌基因的激活从而导致细胞生长失控,细胞基质间黏附及细胞信号传导异常密切联系。因此,探索子宫内膜癌发生的分子学基础,寻找安全可靠的切入点抑制子宫内膜癌细胞生长,转移,对预防子宫内膜癌的发生和改善子宫内膜癌患者的预后,保护我国妇女健康具有重大意义。MicroRNA(miRN A)是近年来发现的一类保守的长度为19～24个碱基的非编码RNA分子,广泛存在真核生物体内,其通过与靶基因mRNA3’非翻译区(3’UTR)相对应的靶序列完全或不完全的互补结合,抑制或促进mRNA降解,调节基因,这些仅占人类基因1%的miRNA分子,却调控着人类三分之一以上基因的表达、修饰、转录和翻译的过程,对细胞增殖、分化及凋亡等生物学功能起着重要的调控作用。miRNA是肿瘤研究领域中的热点,其包括miRNA表达谱筛选,分子结构,调控机制,靶基因预测等研究。越来越多的研究证实,niRNA在多种恶性肿瘤中存在表达异常,在肿瘤中高表达的niRNA可能发挥癌基因的作用,而低表达的miRNA发挥抑癌基因作用。miRNA的发现可能成为极有应用价值的分子标志物,为恶性肿瘤的早期诊断和预后评估提供新方向。miR-944是目前学者关注的新焦点,目前国内外对关于miR-944功能的报道还比较少,初步研究发现：miR-944在子宫内膜癌、宫颈癌及胰腺癌等恶性肿瘤中表达显著增高,我们推测其在肿瘤中发挥癌基因的作用。但迄今为止,对子宫内膜癌组织进行差异表达miRNA的筛选及分析研究甚少。本课题旨在阐明子宫内膜癌组织中的miRNA表达谱及miR-944对子宫内膜癌生物学行为影响及调控作用的机制研究。研究内容包括以下四部分：第一部分 子宫内膜癌组织中差异表达miRNA的筛选研究目的：筛选出子宫内膜癌组织中的差异表达的miRNA分子,获得子宫内膜癌miRNA表达谱,寻找新的诊断标志物。方法：收集3例子宫内膜癌患者的癌变内膜组织和3例正常对照组子宫内膜组织,提取RNA,应用丹麦Exiqon公司的miRCURYTM LNA miRNA芯片,筛选出子宫内膜癌组织中的差异表达的miRNA分子,采用实时定量逆转录聚合酶链反应(qRT-PCR)在样本中进行验证。结果：1.3例癌组织和3例正常内膜组织的总RNA抽取及质检,结果显示,所提取的总RNA的电泳可见带28S和18s条带,260／A280的值都介于1.8-2.1之间,检测RNA检测结果符合杂交芯片实验要求。2. miRNA芯片结果显示：子宫内膜癌组织与正常子宫内膜组织存在有显著差异表达的miRNA:有14个miRNA表达上调,6个miRNA表达下调。3.采用qRT-PCR方法对上调的miR-944、miR-373及下调的miR-548、miR-885进行验证,结果显示：子宫内膜癌中miR-944、miR-373上调的倍数为3.13倍和4.2倍,1niR-548、miR-885下调倍数为2.08倍及3.84倍,与芯片结果比较,趋势一致。结论miRNA表达谱芯片可用于分析子宫内膜癌组织miRNA表达谱；通过miRCURYTMLNA miRNA芯片筛选结合qRT-PCR验证,共得到14个显著上调6个显著下调的miRNA,为下一步开展子宫内膜癌组织niRNA的研究及功能学研究提供实验基础。第二部分 子宫内膜癌组织中miR-944表达及其与临床病理特征的关系目的：探讨miR-944在子宫内膜癌组织中的表达,并分析其与临床病理特征的关系。方法：收集2012年3月—2014年4月在广西医科大学第一附属医院进行手术治疗的子宫内膜癌患者的癌变内膜组织40例,收集同期因子宫肌瘤等良性病变行子宫切除术的正常子宫内膜组织25例作为对照。采用qRT-PC R方法进行miR-944表达水平的相对定量检测,并分析其与患者临床病理特征的关系。结果：1.miR-944在子宫内膜癌组织及正常子宫内膜组织中的表达子宫内膜癌组miR-944的表达水平高于及正常内膜组(P<0.05)。2.miR-944与临床病理特征的关系miRNA-944的表达与组织学分级、病理类型、淋巴转移、肌层浸润深度及FIGO分期因素相关,均有统计学意义(P<0.05),与年龄无相关性。结论：miR-944在子宫内膜癌组织中高表达,提示miR-944可能参与子宫内膜癌发生及发展；miR-944的表达与组织学分级、病理类型、淋巴转移、肌层浸润深度及FIGO分期因素相关,可能可以预测子宫内膜癌的恶性程度及不良预后。第三部分 miR-944对子宫内膜癌细胞生物学行为的影响目的：探讨miR-944对子宫内膜癌Ishikawa细胞和KLE细胞生物学行为的影响。方法：人工合成miR-944的模拟物mimics及抑制物inhibitor,利用阳离子脂质体法,分别转染至人子宫内膜癌Ishikawa细胞和KLE细胞中。设置阴性对照组及空白对照组。采用Cell Counting Kit-8(CCK-8)法对比转染前后细胞增殖生长能力的区别；流式细胞学对比转染前后细胞凋亡情况的区别；Transwell小室法对比转染前后细胞迁移和侵袭能力的区别。结果：1.细胞转染效果荧光倒置显微镜观察转染后的miR-944 mimics的转染效率,通过荧光镜下视野与光镜下视野对比,Ishikawa细胞和KEL细胞的转染效率大约为85%。2. miR-944-mimics及miR-944-inhibitor(?)子宫内膜癌Ishikawa细胞KLE细胞生物学行为的影响。(1)CCK8法检测细胞增殖实验分别在(24h、48h、72h、96h)四个时间点行CCK8检测Ishikawa和KLE细胞的OD值,结果显示,相对于对照组细胞,转染了miR-944mimics的Ishikawa细胞和KLE细胞增殖活性均增强,转染了niR-944inhibitor的Ishikawa细胞和KLE细胞增殖活性均降低(P<0.05)。(2)流式细胞术检测细胞凋亡对miR-944转染48h后的Ishikawa细胞进行流式细胞术细胞凋亡分析,结果显示,B组、NC组、miR-944inhibitor组和miR-944mimics组凋亡率分别为0.58±0.06%、0.66±0.07%、11.74±0.19%、0.68±0.03%, miR-944inhibitor组凋亡率明显高于B组(P<0.05),niR-944mimics组凋亡率与B组差别无统计学意义(P<0.05)。对miR-944转染48h后的KLE细胞进行流式细胞术细胞凋亡分析,结果显示,B组、NC组、miR-944 inhibitor组和miR-944mimics组凋亡率分别为2.55±0.23%、2.53±0.10%、5.13±0.14%、2.99±0.18%,miR-944inhibitor凋亡率明显高于B组(P<0.05),miR-944mimics组凋亡率与B组差别无统计学意义(P<0.05)。(3)细胞侵袭实验检测转染48h后各组KLE细胞迁移能力,对穿膜细胞进行拍照和计数,结果显示,转染miR-944 mimics的KLE细胞穿膜数量较B组明显增多(P<0.05)；转染miR-944 inhibitor的KLE细胞穿膜数量较B组明显减少(P<0.05)。Ishikawa细胞过膜后铺展性不好,拍照后无法计数,CCK8方法检测过膜细胞,结果显示：相对于对照组细胞,转染了miR-944 mimics的 Ishikawa细胞OD值高,间接反映了mimics组的穿膜数量多；转染miR-944 inhibitor 的 Ishikawa细胞OD低,间接反映了inhibitor组的穿膜数量少(P<0.05)。结论：miR-944可促进子宫内膜癌细胞的增殖,侵袭与转移能力,降低miR-944水平可促进细胞凋亡,表明miR-944可能发挥癌基因的作用参与子宫内膜癌的发生发展。第四部分 miR-944对子宫内膜癌细胞生物学行为调控的靶基因预测及鉴定目的：预测并实验证实miR-944的靶基因,初步探讨miR-944的生物学机制。方法：登陆1nicroRN A库及靶基因预测的网站,在线检测或下载靶基因预测软件,综合运用TargetScan(http://genes.mit.edu/targetscan)、Mirbase (http://mirbase.org)、miRanda (http://www.microrna.org)生物信息筛选miR-944最可能的靶基因。Western blot (WB)对比转染前后细胞表达靶基因的区别。构建最可能的靶基因的3’UTR双荧光素酶报告载体,检测荧光素的活性以期在基因水平上验证靶基因上存在miR-944的作用靶点。结果：1. 预测miR-944的靶基因通过预测软件miRanda、Mirbase及TargetScan预测miR-944的靶基因,三个软件交集的niRNA-944靶基因共70个；登陆基因库,查询以上靶基因功能,尤其注意与恶性肿瘤侵袭转移密切相关的功能基因。最后选择非受体型蛋白酪氨酸磷酸酶14(protein tyrosine phosphatase non-receptor type 14,PTPN14)作为miR-944的可能靶基因来进一步研究。应用Targetscan预测miR-944与PTPN14基因的结合位点。2.蛋白水平验证PTPN14是否为miR-944的靶基因miR-944mimics组的KLE细胞的PTPN14蛋白表达量与B组比较下降,差异有统计学意义(P<0.05)；niR-944inhibitor组则高于B组,差异有统计学意义(P<0.05)表明miR-944模拟物能降低KLE细胞中PTPN14蛋白的表达,B组与NC组比较无统计学意义。在Ishikawa细胞中,miR-944mimics组,miR-944 inhibitor组的PTPN14蛋白表达量与B组均无差异(P>0.05)。3. miR-944与PTPN14的结合结合靶点验证将niR-944mimics与连接了PTPN14基因3’-UTR区的pmirGLO载体共转染KLE细胞,实验设立阳性对照组及阴性对照组,重组报告质粒的荧光素酶活性,结果显示与对照组比较,实验组的荧光素酶活性显著下调,差别有统计学意义(P<0.05)结论：PTPN14是miR-944是其中一个靶基因,抑制PTPN14的表达,可能是miR-944促进子宫内膜癌细胞增殖及侵袭转移的作用机制之一。