背景:卵巢癌(Ovarian carcinoma,OC)属女性三大恶性肿瘤,虽发病率小于宫颈癌和宫体癌,但却是女性生殖系统恶性程度最高的癌症。卵巢癌患病时早期症状不明显,且缺乏可靠的早期诊断手段,约有70%的患者在确诊时已进入到疾病进展期。卵巢癌的早期诊断,是关系到病人预后的最重要的因素。基因芯片技术已成为卵巢癌的早期诊断方法之一。外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cells,PBMC)除淋巴细胞和单核细胞外,也包含一些循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)和肿瘤干细胞(tumor stem cells,TSCs),在肿瘤病患中的改变可以体现机体的微环境变化。本文利用基因芯片技术检测卵巢癌患者和健康人对照的外周血中,PBMC基因表达谱的差异,不仅有利于卵巢癌的早期诊断,且还可能揭示卵巢癌发病、转移中的机制。单链抗体(single-chain fragment variable,sc Fv)是由抗体的重链和轻链的可变区经过一段15~20个氨基酸的片段连接而成,是有功能抗体的最小的形式。单链抗体的相对分子质量小,组织穿透能力强,免疫原性低,在肿瘤的诊断和治疗上有着广泛的应用,如将单链抗体连接放射性标记物,应用于肿瘤组织的原位成像,或连接抗肿瘤的细胞毒素或化疗药物,进行肿瘤的治疗等。本文利用酵母展示技术,成功构建了卵巢癌患者的单链抗体库,并用卵巢癌A2780细胞株对抗体库进行了初步筛选,为今后进一步获取可以应用于临床的单链抗体提供了基础。目的:一、应用基因芯片技术检测卵巢癌患者和健康人对照的外周血中,PBMC的基因表达谱差异,筛选卵巢癌患者差异表达基因(differentially expressed genes,DEG),对差异基因进行基因通路(pathway)分析、基因本体论(GO)分析和功能分析。二、构建卵巢癌患者的酵母展示单链抗体库,对构建的单链抗体库测定库容进行初步评价,并用卵巢癌细胞株A2780对抗体库进行初步筛选,为进一步获取高亲和力的卵巢癌单链抗体提供基础。方法:一、提取临床确诊为卵巢癌的8例患者和4例健康女性的外周血中的PBMC样本,提取PBMC中的总RNA,将卵巢癌患者的样本两两混合成四份样本,以减少样本间差异。利用商业化基因芯片Affymetrix?Human Genome U219 Array Strip对两组样本进行转录本基因表达量的检测,利用软件和在线网站对结果进行分析。二、取13例卵巢癌患者外周血分离PBMC,TRIzol法提取PBMC总RNA,逆转录PCR合成出cDNA,利用设计的引物扩增出全套轻链可变区(VL)和重链可变区(VH)基因片段。使用重叠延伸PCR(SOE-PCR)将轻、重链基因片段连接。利用真核细胞体内同源重组系统介导的间隙修复(gap-repair)机制,将连接好的单链抗体片段和线性化的质粒p YD1同时转入酵母菌中。使用不含色氨酸的筛选培养基进行转化后的筛选。在半乳糖存在的诱导培养基中,酵母将单链抗体表达于酵母细胞表面,建立卵巢癌患者的单链抗体库。而后使用卵巢癌细胞株A2780与表达单链抗体的酵母细胞进行结合,利用流式细胞术对可结合A2780细胞的酵母菌株进行初步筛选。结果:一、基因芯片检测后分析发现,卵巢癌患者PBMC相比健康人PBMC中差异表达基因共1158个(Fold Change绝对值>2倍,p<0.05),其中上调的差异表达基因有311个,下调的差异表达基因847个。上调差异最大的5个基因是THBS1、NR4A2、BTG1、ADM、MIR22,下调差异最大的5个基因是GIMAP8、CX3CR1、GIMAP4、ST8SIA4、MYOM2。对差异基因进行通路分析后发现,涉及的通路主要分布在信号转导系统和免疫系统。对差异基因进行GO功能富集分析后发现,差异基因在细胞组成分析中,主要涉及细胞组分和细胞器,在分子功能分析中主要具有结合和催化活性,同时在生物学过程分析中,主要对细胞过程和代谢过程起作用。对差异基因进行功能分析后,在分类为凋亡的基因与GO分析为免疫系统过程的结果取交集,共筛选出有意义的差异基因6个。二、利用PCR方法成功扩增出部分VH、VL基因片段,VH、VL连接后和线性化的质粒共同转化进入酵母菌中,在筛选培养基中有菌落生长,表明转化成功。对建立的单链抗体库进行了库容的检测,测定库容为:κ链抗体库库容为4×109、λ链抗体库库容为8×109。使用卵巢癌细胞系A2780对抗体库进行了筛选,共得到展示VH-VLκ链阳性的酵母菌株49株,展示VH-VLλ链阳性酵母菌株90株。结论:一、卵巢癌患者和健康对照人群的PBMC中基因表达谱存在显著差异,筛选的卵巢癌患者差异基因为进一步研究卵巢癌提供了基础。二、利用酵母表面展示系统成功构建出卵巢癌的单链抗体库,并在诱导下在酵母细胞表面表达抗卵巢癌细胞的单链抗体,利用卵巢癌肿瘤细胞系A2780对抗体库进行了初步筛选,为以后进一步获取高亲和力的卵巢癌单链抗体提供了基础。