亚洲镰孢菌(Fusarium asiaticum)是我国小麦赤霉病发生最为严重的江淮流域和西南麦区的主要病原菌。近年来,随着全球气候变暖和耕作制度的改变,小麦赤霉病在我国长江中下游和黄淮冬麦区呈逐年加重的趋势。该病害侵染主要发生在小麦抽穗扬花期,靠风雨传播,引起穗腐。该病害不仅会造成严重的产量损失,而且该病菌产生的DON毒素对人畜有毒害作用。当前常用的杀菌剂多菌灵防治小麦赤霉病已产生严重的抗药性,因此研究它的抗性机理并如何避免产生抗药性成了一项重大课题。已知亚洲镰孢菌中存在两个β-微管蛋白基因:β1-tub和β2-tub基因,其中β1-tub基因编码的氨基酸序列与其它真菌的β-微管蛋白基因的同源性在90%以上,但只含3个内含子;而β2-tub基因编码的氨基酸序列与β1-tub基因的同源性只有77%,内含子有6个,与其它真菌的β-微管蛋白基因数量相同。先前的研究表明,亚洲镰孢菌对多菌灵的抗药性是由于β2-tub基因的点突变引起的,β1-tub基因的缺失也会导致杀菌剂的抗性水平大大增加。然而,我们对β1-tub基因的点突变知之甚少。在本文研究中,我们证明β1-tub基因的第3位和第193位氨基酸点突变能影响对多菌灵的敏感性。实验结果显示,在敏感菌株中,β1-tub点突变S-β1E3K和S-β1V193F都能减慢菌丝生长,且影响菌株对多菌灵的药敏性,S-β1E3K对多菌灵的敏感性增加,而S-β1V193F对多菌灵的敏感性降低;在以高抗菌株JT04为出发菌株中,β1-tub点突变R-β1E3K和R-β1V193F都能减慢菌丝生长,而且对多菌灵的抗药性比亲本菌株更高。qRT-PCR结果显示,点突变S-β1E3K、R-β1E3K和R-β1-V193F,它们β1-tub的mRNA表达量水平显著上调,但在S-β1V193F突变体中是β2-tub的mRNA表达量水平显著上调。分子对接模型分析,显示点突变E3K和V193F的β1-tub与多菌灵分子亲和力下降。亚洲镰孢菌β2-tub基因是苯并咪唑类杀菌剂的重要靶基因,李雁军通过分别敲除β2-tub基因的6个内含子发现缺失第4个内含子显示对杀菌剂多菌灵的药敏性增加,缺失第1个或第2个内含子表现出对多菌灵的敏感性下降。在本章研究中,我们深入探究了第4个内含子的分子机制,通过分段敲除、序列增长和序列替换的方法获得突变体,找到了一些比较重要的内含子序列。结果表明,敲除第4个内含子的第2段(第13～24bp,命名为Δβ2i4-2)显示菌丝生长变慢,对多菌灵的药敏性增加;敲除第1段(第1～12bp,Δβ2i4-1)、第 4 段(第 37～48bp,Δβ2i4-4)和第 5 段(第 49～58bp,Aβ2i4-5)导致β2-tub基因的cDNA序列移码突变,菌丝生长显著变慢,对多菌灵变得非常敏感;而序列增长和替换对亚洲镰孢菌的生物表型和药敏性没有显著影响。此外,qRT-PCR显示β2-tub基因的mRNA转录水平在Δβ2i4-2突变体中显著下调,在序列增长突变体中显著上调;而在Δβ2i4-1等cDNA序列移码突变体中虽然不表达β2-tub基因的mRNA,但β1-tub基因的mRNA转录水平显著上调。总体而言,本章研究结果表明,亚洲镰孢菌内含子的两端含有较长的剪接识别区域,第2段(12bp)内含子序列决定了第4个内含子的调控作用。基于RIP技术,实验室前期实验发现与亚洲镰孢茵β2-tub mRNA水平互作蛋白基因有很多,但有些互作强度高的假定蛋白还没有功能性地表征。在本文研究中,我们描述了亚洲镰孢菌β2-tub mRNA水平互作蛋白FaSed1p和FaChr基因的生物学功能。结果表明,FaSed1p和FaChr基因敲除体(命名分别为AFaSed1p和ΔFaChr)菌丝生长正常,但产孢量显著下降;而且ΔFaSed1p致病力显著下降,菌丝穿透能力下降,外源添加胁迫因子过氧化氢、刚果红和氯化钠也会显著抑制菌丝生长。另外,ΔFaSed1p和ΔFaChr不影响对多菌灵和戊唑醇的药敏性,表明FaSed1p和FaChr基因虽然与β2-tub mRNA水平互作强度高,但不调控对多菌灵和戊唑醇的药敏性,而FaSed1p基因在细胞壁的稳定方面表现重要作用。