蛋白质的非正常磷酸化是人类肿瘤等病发生的重要原因。以蛋白激酶作为药物靶点，寻找与之相互作用的小分子化合物，并将其中具有激酶活性抑制剂性质的小分子化合物用于新药研发，是当今蛋白激酶研究领域的一个重要方向。本研究中，我们以参与染色体分离和胞质分裂且又在多种肿瘤组织中过量表达的AuroraB激酶为靶标，对其小分子抑制剂进行了高通量筛选研究。 我们首先建立了AuroraB体外活性蛋白的高效原核表达体系。通过比较不同融合蛋白的表达效率和纯化效果，依据融合片段小，表达效率高，纯化效果佳，且具有体外激酶活性等选择标准，确定将His6-AuroraB原核表达系统大规模表达目标蛋白。利用亲和纯化蛋白方法从发酵的30升菌液中总共获得了1000mg具有体外磷酸化活性的AuroraB激酶蛋白。在此基础上，我们建立了基于同位素标记的液体闪烁计数蛋白激酶活性测试方法的AuroraB激酶抑制剂的高通量筛选模型。在此模型中，我们以MBP (Myelin Basic Protein) 作为激酶反应的底物。根据AuroraB的酶学动力学特征，确定了适宜于高通量筛选的底物浓度(ATP25uM，MBP20uM)和线性反应时间。在明了化合物溶剂DMSO对于整个模型的运行无显著影响后，应用已知蛋白激酶抑制剂星孢菌素(Staurosporine)进行测试，实验结果证明，我们构建的筛选模型完全符合高通量筛选的要求。 采用这个高通量筛选模型，我们对国家新药筛选中心库藏的70，000个小分子化合物进行了高通量筛选。在第一轮筛选中，我们在40uM的化合物浓度下，以90％的酶活性抑制率为阳性化合物阈值，筛选到了882个一级阳性化合物。然后在4uM化合物浓度，以70％的酶活性抑制率为阳性化合物阈值，从一级阳性化合物中筛选出76个二级阳性化合物。经IC<,50>测试，其中有8个化合物的IC<,50>位于0～100nM之间，8个化合物的IC<,50>位于100～500nM之间，12个化合物的IC<,50>位于500～1000nM之间，其余48个化合物的IC<,50>位于1000～10000nM之间。 我们随后考察了其中一个阳性化合物IFVR001的抑制肿瘤效果，结果显示，在细胞水平，IFVR001能够显著的抑制多种肿瘤细胞系的生长。其中，对于人类肝癌细胞系HepG2生长的抑制效果最为强烈，其IC<,50>为0.82uM。对IFVR001在动物水平抑制肿瘤效果的检测发现，该化合物能够显著的抑制小鼠肝癌H22的瘤体生长，其抑制效果在相同剂量水平下优于已运用于临床肿瘤治疗的化疗药物5氟尿嘧啶。IFVR001与已报道的Aurom Kmases抑制剂相比较，它具有更强的体外激酶活性抑制效果。 “重大新药创制”是我国“十一五”科技发展中长期规划中的重大专项研究计划之一。其中“从基因到药物”的新药创制路线被列为该计划的首选策略。本论文的研究工作虽然尚未取得重大的突破性进展，但我们在国家需要我们去开展的研究方向上，进行了有益的尝试，并取得了一些初步的经验和若干有价值的新药小分子先导化合物。我们还将继续努力，在总结经验的基础上争取作出更好的成绩。 甘氨酸酰基转移酶(GLYAT)是与哺乳动物内源和外源羧酸及其异生物的排泄以及脱毒密切相关的一个生化代谢酶家族。在代谢过程中，该家族酶类作为一个重要催化因子催化酰基基团从辅酶A硫代酸脂转移到甘氨酸的氨基的转移过程。该家族酶类的异常与哺乳类动物的有机酸血症及其相关病理进程有密切联系。 迄今为止，甘氨酸酰基转移酶 (GLYAT) 编码基因的研究资料极为匮乏。我们在这里报道了一个新的甘氨酸酰基转移酶(GLYAT)编码基因的分子克隆与初步功能研究。该基因被命名为GLYATL1。其eDNA全长1546bp，开放阅读框(ORF)编码一个全长302个氨基酸的多肽。GLYATL1基因由7个外显子和6个内含子构成，定位在染色体11q12.1区段，与同家族另外两个成员毗邻。组织表达谱分析表明，GLYATL1在肝脏、肾、胰腺、睾丸、卵巢、胃有存在表达，其中，在肝脏中表达强度最高，在肾脏表达强度次之，在卵巢，睾丸，胰腺，胃中的表达强度最弱。在cos-7细胞中的亚细胞定位分析显示，GLYATL1是一个胞质蛋白，并且呈点状定位于细胞质中。 采用双荧光素酶报告系统，我们考察了GLYATL1在HEK293T细胞中对于信号通路的影响。在总共受试的11种信号通路中， GLYATL1显著的提高了HSE信号通路的转录活性。进一步的研究表明，GLYATL1对于HSE信号通路的激活作用呈现出剂量依赖型的特点，这为该基因在细胞水平功能的深入研究提供了重要的线索。