【摘 要】
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目的:水杨酸钠（阿司匹林的活性成分）是非甾体类抗炎药,通常用于治疗类风湿关节炎,水杨酸钠诱导的耳鸣模型一直用于鉴定耳鸣的生物学机制。据报道,由水杨酸钠引起的耳鸣与耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤有关。程序性坏死是新近提出的一种受调控的细胞坏死方式,研究发现,受体相互作用蛋白激酶-3（RIPK3）介导的程序性坏死途径参与噪音诱导的外毛细胞损伤和哇巴因诱导的螺旋神经节损伤。此外,本课题组前期研究发现c
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目的:水杨酸钠（阿司匹林的活性成分）是非甾体类抗炎药,通常用于治疗类风湿关节炎,水杨酸钠诱导的耳鸣模型一直用于鉴定耳鸣的生物学机制。据报道,由水杨酸钠引起的耳鸣与耳蜗毛细胞和螺旋神经节细胞的损伤有关。程序性坏死是新近提出的一种受调控的细胞坏死方式,研究发现,受体相互作用蛋白激酶-3（RIPK3）介导的程序性坏死途径参与噪音诱导的外毛细胞损伤和哇巴因诱导的螺旋神经节损伤。此外,本课题组前期研究发现caspase-3介导的凋亡途径参与水杨酸钠诱导豚鼠耳鸣,而利用caspase抑制剂干预时,螺旋神经节凋亡细胞减少不明显,其可能存在不依赖caspase-3的死亡途径,我们推测,RIPK3介导的程序性坏死途径可能也是水杨酸钠诱导耳鸣发生过程中的关键途径。因此本研究目的在于探究水杨酸钠诱导大鼠螺旋神经节细胞损伤是否通过激活受体相互作用蛋白激酶-1（RIPK1）/RIPK3/混合系列蛋白激酶样结构域（MLKL）途径发生程序性坏死,以及程序性坏死特异性抑制剂Necrostatin-1（Nec-1）对水杨酸钠致螺旋神经节细胞损伤的保护作用,为深入探讨耳鸣机制提供依据。方法:实验前和取材前所有大鼠均行听性脑干反应（ABR）和畸变产物耳声发射（DPOAE）检查,实验前根据ABR和DPOAE筛选出ABR阈值0.05）;水杨酸钠组与APL组比较,4444Hz、5714Hz和8000Hz频率的幅值轻微下降,2222Hz、2963Hz和10000Hz频率的幅值均轻微上升,但差异无统计学意义（P>0.05）;Nec-1组通过Nec-1抑制后与水杨酸钠组相比,除2222Hz频率的幅值升高外（P>0.05）,其余频率的幅值均下降,其中4444Hz、5714Hz和10000Hz差异具有统计学意义（P=0.001;P0.05）,其余频率的幅值均下降,其中4444Hz、5714Hz和10000Hz差异具有统计学意义（P=0.002;P=0.001;P=0.028）;Nec-1组与APL组相比,除2963 Hz频率的幅值升高外（P>0.05）,其余频率的幅值均下降,其中4444Hz、5714Hz、8000Hz和10000Hz差异具有统计学意义（P=0.001;P<0.0001;P=0.049;P=0.013）。HE结果显示:给药后与对照组、APL组相比,在水杨酸钠组的SGN出现坏死性变化明显（P<0.0001;P<0.0001）,Nec-1组经过抑制剂Nec-1处理与水杨酸钠组相比,SGN坏死细胞数减少（P<0.0001）,但与对照组和APL组相比,坏死细胞数仍有升高（P<0.0001;P<0.0001）,而对照组与APL组坏死细胞数差异无统计学意义（P=0.324）。q RT-PCR结果显示:各组间RIPK1 m RNA的表达量有明显差异（F=21.303,P<0.0001）,在对照组和APL组中以最低水平表达,在水杨酸钠组中表达强烈增加（P<0.0001;P<0.0001）,Nec-1组通过Nec-1处理可以显著降低水杨酸钠诱导的RIPK1 m RNA的增加水平（P=0.001）,但Nec-1组和对照组、APL组比较,RIPK1 m RNA水平仍有升高（P=0.002;P=0.044）。RIPK3 m RNA的表达趋势与RIPK1 m RNA结果一致,在对照组和APL组中以最低水平表达,在水杨酸钠组中表达强烈增加（P=0.001;P=0.001）,Nec-1组通过Nec-1处理可以显著降低水杨酸钠诱导的RIPK3m RNA的增加水平（P=0.001）,但Nec-1组和对照组、APL组比较,RIPK3m RNA水平仍有升高（P=0.014;P=0.038）。MLKL m RNA的表达趋势与RIPK3 m RNA结果一致,在对照组和APL组中以最低水平表达,在水杨酸钠组中表达强烈增加（P<0.0001;P<0.0001）,Nec-1组通过Nec-1处理可以显著降低水杨酸钠诱导的MLKL m RNA的增加水平（P=0.001）,但Nec-1组和对照组、APL组比较,MLKL m RNA水平仍有升高（P=0.009;P=0.018）。免疫组化结果显示:RIPK1、RIPK3和MLKL主要表达在细胞质、细胞膜及部分细胞核处。在对照组和APL组SGN区域几乎不表达,水杨酸钠增加了SGN中RIPK1、RIPK3和MLKL的表达,而在Nec-1处理后,RIPK1、RIPK3和MLKL蛋白的表达较低,但Nec-1处理组仍较对照组表达升高。该蛋白质表达模式与m RNA表达模式一致。结论:在水杨酸钠致SGN损伤中存在RIPK1/RIPK3/MLKL介导的程序性坏死,抑制程序性坏死以保护SGN免受死亡,可能是治疗耳鸣和SGN疾病相关性听力损失的一种手段。
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