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中温α-淀粉酶是重要的工业酶制剂之一,广泛用于淀粉糖生产、味精生产、啤酒和酒精生产中辅料的加工、织物退浆、以及其它酿造、有机酸和医药行业。目前,国内主要的工业生产菌株为BF-7658和Bacillus sp. M13。近20年来,我国学者一直未对中温α-淀粉酶生产菌株进行有效的遗传改良,使得其发酵生成水平落后于世界先进水平。因此,通过现代育种技术对中温α-淀粉酶工业生产菌株进行遗传改良,将有助于提升我国中温α-淀粉酶的发酵生产水平,实现其高效低成本制备。本课题以中温α-淀粉酶工业生产菌株B. amyloliquefaciens CICIM B2125为研究对象,纯化了该菌株产生的中温α-淀粉酶并进行了酶学性质研究;克隆了中温α-淀粉酶全长基因并验证了该基因的功能;对中温α-淀粉酶基因进行了定点突变,改变了中温α-淀粉酶的酶学性质;建立了中温α-淀粉酶工业生产菌株的遗传转化方法,并通过提高中温α-淀粉酶基因拷贝数显著增强了α-淀粉酶的分泌。1.纯化了B. amyloliquefaciens CICIM 2125产生的α-淀粉酶(BAA)并首次确定了纯酶的酶学性质。通过纯化,从发酵液中获得了电泳纯的BAA。酶回收率为20.1%,纯化倍数为26.9。对纯化的BAA的酶学性质进行了测定,该酶的分子量为58 kDa,最适反应温度为55℃,最适反应pH为6.0-9.0。pH稳定范围为7.0-10.0。添加10 mmoL/L Ca2+,可以使酶在55℃下保温1 h,还残留85%左右的活力。无Ca2+情况下,该酶在55℃下保温15 min,丧失活力。Ca2+,Mn2+,Co2+可以显著增强酶的活力。薄层层析分析表明:酶的淀粉水解产物主要为糊精和一些寡糖。2.克隆了BAA全长编码基因amyQ。该基因由启动子区(220 bp),结构基因(1544 bp)及终止序列(320 bp)构成。在启动子区有3个碱基序列发生了改变,分别位于-49位的碱基发生改变(C→T),-79和-80位的碱基由(TA→AT),结构基因与已报到的BAA编码基因(GenBank登录号:J01542)一致。3.克隆的amyQ基因在大肠杆菌和枯草芽孢杆菌中获得活性表达。将无信号肽的BAA结构基因(amyQ’)克隆入表达载体pET-28a,构建了重组载体pET-28a-amyQ’,通过IPTG诱导,在大肠杆菌中表达,重组菌的α-淀粉酶活力为2.8 U/mL培养液。重组酶的相对分子量为58 kDa。将携带有全长基因amyQ的重组载体pLY-amyQ,转化B. subtilis 1A510后,实现amyQ的分泌表达,所表达的重组BAA经纯化后,分析其酶学性质,发现其与天然BAA在酶学性质上没有明显差异。4.进一步选取了BAA中Ca2+结合位点上的3个氨基酸残基(231,233,438)进行定点突变,对突变体的酶学性质进行比较。与天然BAA相比,突变体D233N的比酶活下降了的84.8%;Km上升了55.6%,Kcat值下降了85%;热稳定性明显下降,最适反应温度范围也减小了10℃;最适反应pH下降了0.5个单位,pH稳定范围下降了3-4个单位。与对照相比,突变体D231N和D438G的比酶活分别下降了6.3%和3.5%,Km和Kcat值与对照相比没有显著变化;最适反应温度,热稳定性及最适反应pH及pH稳定性变化不显著。5.成功构建了重组BAA工业生产菌株,产酶水平显著提升。建立了BAA生产菌株优化的电转化方法,转化效率可达4.8×102。将pLY-amyQ转化B. amyloliquefaciens CICIM B2125,获得了携带多拷贝BAA编码基因的重组菌。重组菌在无选择压的培养基上传代100代,质粒稳定性保持在80%左右,可以基本满足工业生产对菌株的遗传稳定性的要求。重组菌的BAA分泌能力与出发菌株相比,在摇瓶水平上提高了50%以上,在30吨生产规模提高了30%左右,发酵周期缩短了8-12 h左右。