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目的:探讨补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖、成骨分化和凋亡的影响。材料与方法:Wistar大鼠,18只,雌雄各半,六周龄,体重200±20g,随机分为三组:空白对照组,补肾健脾活血方组,二甲双胍组,每组6只。根据等临床剂量换算进行灌胃给药:空白对照组灌服蒸馏水,补肾健脾活血方组灌服补肾健脾活血方混悬液,二甲双胍组灌服盐酸二甲双胍混悬液,每日灌胃1次,在第7d给药2h后,腹腔注射麻醉,腹主动脉取血,静置2h后,离心(2500rpm,4℃,20min),收集血清,同组混匀,56℃水浴灭活30min,经滤膜过滤后分装,-86℃保存。实验分为空白对照组、高糖组、中药低剂量组、中药中剂量组、中药高剂量组、二甲双胍组。采用CCK-8法,筛选葡萄糖对MC3T3-E1细胞干预的最适剂量和检测各组成骨细胞增殖率;对硝基苯磷酸盐法(PNPP)检测各组碱性磷酸酶(ALP)活性;ELISA法检测骨钙素(OC)含量;流式细胞术Anexin-V/PI双染法检测成骨细胞凋亡率;蛋白质免疫印记技术(Western-blot)检测成骨分化相关蛋白BMP2和Runx2的表达和凋亡相关蛋白Bax和Bcl-2的表达;实时荧光定量PCR(RT-q PCR)检测BMP2、Runx2、Bax和Bcl-2 m RNA的表达。结果:1.不同浓度葡萄糖对MC3T3-E1细胞增殖抑制率的影响与空白对照组比较,细胞培养24h和48h,葡萄糖浓度为25 mmol/L和33 mmol/L组细胞的抑制率均显著升高,有统计学意义(p<0.01),细胞培养72小时,葡萄糖浓度为16.7mmol/L、25 mmol/L和33 mmol/L组细胞的抑制率均升高(p<0.01或p<0.05)。2.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞增殖能力的影响与空白对照组比较,细胞培养24h、48h和72h,高糖组细胞增殖能力均显著降低(p<0.01);与高糖组比较,细胞培养24h、48h,中药低剂量组细胞增殖能力升高(p<0.05),细胞培养24h、48h和72h,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞增殖能力显著升高(p<0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养24h、48h和72h,中药低、高剂量组细胞增殖能力显著降低(p<0.01);与中药低剂量组比较,细胞培养24h、48h和72h,中药中剂量组细胞增殖能力显著升高(p<0.01)。3.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞成骨分化的影响3.1补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞ALP活性的影响与空白对照组比较,细胞培养1d、3d、5d、7d,高糖组细胞ALP活性均显著降低(p<0.01);与高糖组比较,细胞培养3d、5d、7d,中药低剂量组细胞ALP活性升高(p<0.05或p<0.01),细胞培养1d、3d、5d、7d,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞ALP活性显著升高(p<0.05或p<0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养1d、3d、5d、7d,中药低剂量组细胞ALP活性降低(p<0.05或p<0.01),其他各组无显著性差异(p>0.05);与中药低剂量组比较,细胞培养3d、5d、7d,中药中剂量组ALP活性显著升高(p<0.01)。3.2补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞上清液OCN的影响与空白对照组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,高糖组细胞骨钙素的分泌均显著降低(p<0.01);与高糖组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药中、高剂量组和二甲双胍组细胞骨钙素分泌能力均显著升高(p<0.01);与二甲双胍组比较,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药低剂量组细胞骨钙素分泌能力显著降低(p<0.01),细胞培养5d、7d、14d,中药高剂量组骨钙素分泌能力降低(p<0.05或p<0.01);与中药低剂量组,细胞培养3d、5d、7d、14d,中药中、高剂量组骨钙素分泌能力显著增高(p<0.01)。3.3补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞BMP2、Runx2蛋白表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组的BMP2、Runx2蛋白表达均显著减少(p<0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组和二甲双胍组的BMP2、Runx2蛋白表达量均有所增加(p<0.05或p<0.01);与二甲双胍组比较,中药低、中、高剂量组的BMP2蛋白表达均显著减少(p<0.01),中药低、中剂量组的Runx2蛋白表达减少(p<0.05);与中药低剂量比较,中药中、高剂量组的BMP2、Runx2蛋白表达均无统计学意义(p>0.05)。3.4补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞BMP2 m RNA、Runx2 m RNA表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组的BMP2、Runx2基因表达均显著减少(p<0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组对BMP2、Runx2基因表达均有一定程度的增加(p<0.05或p<0.01);与二甲双胍组比较,中药低、中、高剂量组对BMP2基因表达均显著减少(p<0.01),中药低、中剂量组的Runx2基因表达均减少(p<0.05或p<0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组对Runx2基因表达显著增加(p<0.01)。4.补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞凋亡的影响4.1流式细胞术检测MC3T3-E1细胞凋亡与空白对照组比较,高糖组细胞凋亡率显著增高(p<0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组的细胞凋亡率均显著降低(p<0.01);与二甲双胍组比较,中药低、高剂量组细胞凋亡率增高(p<0.05或p<0.01);与中药低剂量组比较,中药中剂量组细胞早期凋亡率显著减少(p<0.01)。4.2补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞Bax、Bcl-2蛋白表达的影响与空白对照组比较,高糖组Bcl-2/Bax的比值显著减少(p<0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组Bcl-2/Bax的比值增加(p<0.05或p<0.01);与二甲双胍组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax的比值显著增加(p<0.01),中药低、中剂量组均显著减少(p<0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax比值显著增加(p<0.01)。4.3补肾健脾活血方对高糖环境下成骨细胞Bax、Bcl-2 m RNA表达的影响药物干预48h后,与空白对照组比较,高糖组Bcl-2/Bax的比值显著减少(p<0.01);与高糖组比较,中药低、中、高剂量组、二甲双胍组Bcl-2/Bax的比值显著增加(p<0.01);与二甲双胍组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax的比值增加(p<0.05),中药低、中剂量组均显著减少(p<0.01);与中药低剂量组比较,中药高剂量组Bcl-2/Bax比值显著增加(p<0.01)。结论:1.补肾健脾活血方能促进高糖环境下MC3T3-E1细胞的增殖与分化。2.补肾健脾活血方对高糖环境下MC3T3-E1细胞凋亡有抑制作用。