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目的:探讨以骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)诱导成的软骨细胞与纳米羟基磷灰石/壳聚糖支架(nano-hydroxyapatite/chitosan scaffold,nano-HA/CS scaffold)构建组织工程骨软骨复合体,修复兔膝关节软骨及软骨下骨缺损的方法及结果,初步评价通过构建组织工程骨软骨复合体修复动物体内骨软骨缺损这一新方法的价值。方法:1、运用密度梯度离心法分离、培养兔BMSCs。2、BMSCs的鉴定:形态学观察;流式细胞法观察BMSCs的表面抗原,细胞周期和细胞活力。3、用特定诱导液将BMSCs向成软骨细胞定向诱导分化,通过形态学观察和甲苯胺蓝等进行分析鉴定。4、通过原位复合和冷冻干燥相结合的方法制备nano-HA/CS支架,并进行扫描电镜观察。5、把软骨细胞与nano-HA/CS支架的复合、穿“靴”培养,进行扫描电镜观察。6、把组织工程骨软骨复合体植入到兔膝关节骨软骨缺损中,分别于术后第4、12周取材,通过大体观察和组织学检查等评价修复缺损情况。结果:1、密度梯度离心法能获得兔BMSCs,可在体外分离扩增。2、经流式细胞仪分析,BMSCs的细胞表明抗原CD29表达为91.05%,CD44表达为91.02%,CD34表达为0.21%,CD45表达为0.10%:细胞活力为95.27%,G0-G1细胞占94.68%。BMSCs形态为长梭形。3、特定诱导液诱导后BMSCs的细胞形态发生变化,由梭形向椭圆形及三角形分化,甲苯胺蓝染色为阳性。4、扫描电镜下观察nano-HA/CS支架具有多孔结构;测得的支架孔隙率为90%,孔径在50～200μm,平均为150μm。5、扫描电镜观察软骨细胞可在nano-HA/CS上较好的粘附生长;复合14天时没被“靴”隔绝培养基的支架底部空隙深处也有细胞分布,而被“靴”隔绝培养基的支架顶部只有少量细胞黏附。6、经术后4周、12周观察和组织学评分,复合体修复缺损处有骨组织和软骨组织形成,成骨区和成软骨区界面耦合情况实验组明显优于对照组。结论:1、密度梯度离心法可获得兔BMSCs,它可在体外长期、稳定培养,是理想的组织工程种子细胞。2、BMSCs在特定诱导液内可向软骨定向分化。3、nano-HA/CS支架具有较好的细胞相容性。4、经穿“靴”结构构建的组织工程化骨软骨复合体可修复兔软骨及软骨下骨缺损。