第一章RAB15促进食管鳞状细胞癌侵袭转移的临床意义及分子机制研究研究背景食管癌是最常见的恶性消化道肿瘤之一,包括食管鳞状细胞癌（ESCC）和食管腺癌（ESCA）两种主要的病理类型。中国是ESCC发病率和死亡率最高的国家,显著的地理分布差异,提示了遗传因素和环境因素所发挥的重要作用。食管癌具有起病隐匿、易侵袭转移和复发的特点,大多数患者是死于肿瘤的远处转移和复发,这是提高治疗有效率和改善预后的主要障碍。因此,深入研究食管癌复杂的侵袭转移的生物分子机制,寻找潜在的能够预测肿瘤转移的分子标志物以及有效的抑制侵袭转移的分子靶点,是改善中晚期食管癌患者的临床治疗效果和生存预后状态的关键。本研究基于对公共肿瘤数据库TCGA中食管癌转录组数据的挖掘分析,并结合大量临床食管癌组织样本验证,选定了候选癌基因RAB15,进行深入研究。既往研究表明,RAB15参与细胞内的囊泡转运,调控细胞的内吞、胞吐等功能,与小细胞肺癌、肝细胞癌、神经母细胞瘤等多种恶性肿瘤的发生发展具有相关性。但是有关RAB15在食管癌中的功能和分子机制研究却未见报道。因此,本研究利用大量的食管癌组织样本、多种体内外细胞功能学实验和分子生物学实验,初步探讨了 RAB15在食管癌中的表达和临床病理意义、功能和潜在的生物分子机制。研究目的本研究主要对RAB15在食管癌中的表达情况和临床病理意义、生物学功能以及分子调控机制进行初步的探讨和研究。研究方法1.利用生物信息学方法对肿瘤公共数据库的转录组数据进行挖掘,分析RAB15在不同食管癌队列中的表达水平,以及RAB15的表达水平与各种临床病理特征和食管癌患者临床预后的相关性;应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot,检测食管癌组织样本中RAB15在mRNA和蛋白质水平的表达情况。2.应用慢病毒包装和转染系统构建稳定过表达RAB15和稳定敲降RAB15的食管癌细胞株,以此为基础进行后续的体内、外细胞功能试验和生物分子机制研究。进行细胞划痕实验、Transwell迁移和侵袭实验、小鼠尾静脉肺转移模型、小鼠足底腘窝淋巴结转移模型等体内、外细胞侵袭转移实验,检测RAB15对食管癌细胞侵袭转移能力的影响。3.利用Western blot实验,检测RAB15对食管癌细胞内信号通路的影响;应用靶向FAK的小分子抑制剂GSK2256098,并结合Transwell迁移和侵袭实验,检测GSK2256098是否可以回复RAB15促进的侵袭转移。4.利用细胞免疫荧光实验,检测RAB15在食管癌细胞内细胞器定位情况。5.利用免疫共沉淀联合高效液相色谱-质谱联用技术（COIP＆HPLC-MS）,检测食管癌细胞中与RAB15存在相互作用的蛋白质分子;利用COIP和细胞免疫荧光试验,检测RAB15和MICALL1之间的相互作用;利用靶向MICALL1的siRNA干扰其表达,并结合Transwell迁移和侵袭实验,验证干扰MICALL1的表达是否可以回复RAB15促进的侵袭和转移能力。研究结果1.在食管癌组织中,RAB15在mRNA和蛋白质表达水平均显著上调,且与患者临床TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征具有显著的相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,RAB15表达上调与食管癌患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）呈负相关。单因素和多因素COX回归分析显示,RAB15表达上调是判断食管癌患者生存的独立预后因素。2.细胞功能实验表明,过表达RAB15可显著促进食管癌细胞在体内、外的侵袭和转移能力。3.Western blot检测表明,RAB15可以促进食管细胞中FAK信号通路的激活;FAK抑制剂结合Transwell迁移和侵袭实验结果表明,抑制FAK的活性可以回复RAB15促进的食管癌细胞的侵袭和转移能力。4.细胞免疫荧光实验表明,RAB15位于循环内体,参与ITGB1在细胞内的转运过程。5.COIP＆HPLC-MS筛选、COIP＆Western blot验证、细胞免疫荧光实验表明,在食管癌细胞中,RAB15与MICALL1在食管癌细胞中存在相互作用的关系;si-MICALL1结合Transwell迁移和侵袭实验结果表明,RAB15是通过与MICALL1的相互作用,调控FAK信号通路,促进食管癌细胞的侵袭转移。研究结论RAB15在食管癌细胞和组织中均表达上调,且与患者的临床TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征相关。RAB15通过与MICALL1相互作用调控FAK信号通路,促进食管癌的侵袭和转移。RAB15可作为一项独立预后因素,有望成为新的食管癌转移预测的生物标志物和治疗的靶点。第二章 抑癌基因CIDEA在食管鳞状细胞癌中抑制生长和提高顺铂化疗敏感性的临床意义及分子机制研究研究背景在中国,食管鳞状细胞癌（ESCC）的发病率和死亡率都比较高,尚缺乏有效的治疗手段,患者的5年生存率仍比较低。ESCC的发生发展,是一个多因素参与的,多步骤、多阶段的复杂过程;癌基因和抑癌基因功能的失调都发挥了不容忽视的作用。因此,了解食管癌的遗传易感性和分子机制,对于发现早期诊断、有效治疗、预后判断的新靶点,实现食管癌患者的个体化治疗和预后改善具有重要意义。本研究基于对公共肿瘤数据库TCGA中转录组数据的挖掘分析,并结合大量本地食管癌组织样本验证,选择了具有一定预后意义的候选抑癌基因CIDEA进行深入研究。既往研究表明,CIDEA参与细胞的脂质代谢和凋亡过程。也有研究表明,CIDEA在胶质母细胞瘤、肾透明细胞癌组织中表达下调,且与不良预后相关。但是,有关CIDEA在食管癌中的功能和机制研究却未见报道。因此,本研究利用大量的食管癌组织样本、多种体内外细胞功能学实验和分子生物学实验,初步探讨了 CIDEA在食管癌中的表达和临床病理意义、功能和潜在的生物分子机制。研究目的本研究主要对CIDEA在食管癌中的表达情况和临床病理意义、生物学功能以及分子调控机制进行初步的探讨和研究。研究方法1.利用生物信息学方法,对肿瘤公共数据库的转录组数据进行挖掘,分析CIDEA在不同食管癌队列中的表达变化;应用实时荧光定量PCR（qRT-PCR）和Western blot检测食管癌组织样本中,CIDEA在mRNA和蛋白质水平的表达情况。2.利用免疫组织化学染色（IHC）检测食管癌组织芯片中CIDEA的蛋白表达情况,并分析其表达与各种临床病理特征和患者预后的相关性。3.应用生物信息学方法,联合分析肿瘤公共数据库中食管癌的的转录组数据和DNA甲基化数据,探讨CIDEA甲基化水平与mRNA表达水平的相关性,以及CIDEA甲基化水平与食管癌患者总生存期之间的相关性。4.应用亚硫酸氢钠测序（BGS）和甲基化特异性PCR（MSP）,检测食管癌细胞株和食管癌组织中CIDEA启动子区的甲基化状态。5.应用慢病毒包装和转染系统构建稳定过表达CIDEA的食管癌细胞株,以此为基础进行后续的体内外细胞功能试验和生物分子机制研究。6.进行CCK-8细胞增殖实验、平板克隆形成实验、EdU细胞增殖实验、裸鼠皮下成瘤模型等体内、外细胞增殖实验,检测CIDEA对食管癌细胞增殖能力的影响;利用PI染色检测细胞周期分布、Annexin V/PI双染色法检测细胞凋亡、JC-1法检测线粒体膜电位等实验,检测CIDEA对食管癌细胞周期和凋亡的影响;利用Western blot实验,检测食管癌细胞中相关分子指标的变化。研究结果在食管癌组织中,CIDEA在mRNA和蛋白质表达水平均显著下调,且与其启动子区的甲基化程度过高相关。此外,在食管癌组织中,CIDEA的表达下调还与肿瘤组织分化程度、临床TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征具有显著的相关性。Kaplan-Meier生存曲线分析表明,CIDEA表达下调与食管癌患者的总生存期（OS）和无进展生存期（PFS）呈显著负相关。单因素和多因素COX回归分析显示,CIDEA表达下调是判断食管癌患者生存的独立预后因素。体内和体外细胞功能实验揭示了 CIDEA抑癌基因的功能,CIDEA可显著抑制食管癌细胞的体外增殖和体内成瘤能力。此外,在细胞处于应激状态时,如营养匮乏和顺铂化疗造成DNA损伤等,CIDEA可以通过调控JNK-p21/Bad信号通路,促进细胞G1/S期阻滞和细胞凋亡。研究结论CIDEA在食管癌组织中表达下调,并且与食管癌患者的肿瘤分化程度、临床TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征具有相关性。CIDEA在食管癌组织中表达下调,与其启动子区CpG位点的异常甲基化有关。CIDEA通过调控JNK-p21/Bad信号通路,抑制食管癌细胞的增殖,增加其对顺铂化疗的敏感性。CIDEA是判断食管癌患者总生存期和无进展生存期的独立预后因素,有望成为ESCC新的治疗靶点。