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小地老虎(Agrotis ipsilon)是一种危害性极其严重的农业害虫。针对小地老虎的防治主要是以化学农药为主,但随着农药的频繁使用,小地老虎对化学农药的抗药性呈逐年增强的趋势,农药安全问题日益严重,为了达到稳定控制害虫的目的,亟需找到对环境友好型并能有效防治小地老虎的新方法。酪氨酸羟化酶(Tyrosine hydroxylase,TH)催化酪氨酸合成多巴(DOPA),是昆虫黑色素合成通路中的第一步反应,DOPA经多巴脱羧酶(Dopa decarboxylase,DDC)的催化形成多巴胺。多巴胺既是合成黑色素的前体物质,也是一种重要的神经递质,能够调控昆虫表皮黑色素的合成及多种代谢活动。本研究以小地老虎为实验对象,克隆获得小地老虎TH基因全长c DNA序列,并对TH和DDC的蛋白序列进行生物信息学分析;通过q RT-PCR技术对小地老虎不同发育时期及不同的组织中TH和DDC的时空表达水平进行相对定量研究;运用CRISPR/Cas9基因组编辑技术敲除Ai TH和Ai DDC,并检测是否在靶向基因的靶点位置发生了基因突变,筛选突变体并观察与野生型之间的表型差异,分析Ai TH和Ai DDC对小地老虎生长发育的调控作用,研究结果如下:1.构建TH基因和DDC基因的系统进化树发现,Ai TH基因与粘虫(Mythimna separate)和甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的亲缘关系更近,Ai DDC基因与粘虫(Mythimna separate)和甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)的亲缘关系更近些,都可与其他鳞翅目昆虫汇成一支。2.表达模式分析显示:(1)组织表达:对小地老虎各组织中两个基因的相对表达量进行检测后发现,TH和DDC基因在头部和表皮中表达水平较高,这与黑色素产生并发挥功能的场所相一致。(2)龄期表达:TH基因在生长发育的各个阶段都表达,DDC基因在幼虫蜕皮前后发生显著变化,与蜕皮激素和保幼激素的调控相关。3.将Cas9 m RNA及特定基因的sg RNA混合物注入小地老虎胚胎,基因组检测突变发现,Ai TH突变体的TH基因和Ai DDC突变体的DDC基因在靶点处碱基发生了不同类型的变异。4.与野生型相比,Ai TH突变体具体表型为:小地老虎在胚胎时期体型明显变小,发育受阻,不能正常孵化,部分胚胎在孵化成幼虫的第一天严重脱水死亡。敲除小地老虎中DDC基因后,突变个体中黑色素的合成作用明显减弱,低龄幼虫体表毛发毛囊处及头部几乎没有黑色素沉积现象,后期生存免疫力低下,在幼虫期死亡。部分出现嵌合体性状,头部有一半有黑色素的沉积。嵌合体突变体可以存活到成虫期,突变体成虫的翅膀、触角及足颜色偏浅黄,黑色素在身体的分布较少。5.通过实时定量PCR(q RT-PCR)检测分析了CRISPR/Cas9介导的Ai TH突变体中黑色素信号通路TH基因及其他关键基因在m RNA水平上的表达差异,分析显示TH基因在突变体中的表达发生显著性下调,PO基因发生显著性上调,aa NAT、tan、ebony基因发生显著性下调。这表明,Ai TH在小地老虎的生长和发育中起着重要作用,TH基因的突变影响黑色素通路对机体的调控。本研究主要利用基因组编辑CRISPR/Cas9技术对小地老虎的黑色素通路的基因进行了研究和功能验证,表明TH与DDC基因在小地老虎黑色素合成及生长发育中具有十分重要的作用。DDC基因可以作为研究小地老虎遗传转化的Marker基因。利用TH基因的致死性,为昆虫种群遗传调控防治害虫提供了潜在的靶标基因,为有效防控小地老虎种群暴发与危害提供了新思路。