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研究背景和目的:进入21世纪后,随着人类生存环境、生活方式的改变,不孕不育问题正困扰着越来越多的人群。目前,全球10-15%的育龄夫妻存在生育障碍,其中约一半的因素与男性相关,而精子功能障碍则是男性不育的主要原因,因此研究精子功能调控机制对解决男性生殖问题有重要意义。精子进入雌性生殖道后,会发生一系列的生理变化,包括获能、超活化运动、顶体反应等,最终才能与卵细胞完成受精反应。这一系列过程中,精子特异性钾离子通道KSper和钙离子通道CatSper起着至关重要的作用。小鼠模型研究表明,KSper由主亚基SLO3和辅助亚基LRRC52组成。SLO3和LRRC52敲除的雄性小鼠的生殖能力严重受损甚至完全不育。在人精子中,虽然KSper的分子组成仍有待阐明,其特性也与小鼠KSper存在差异,但已有研究报道KSper电流异常与男性不育存在相关性,表明KSper也是调控人精子功能的重要因子。对精子膜电位的调控则是KSper调控精子功能的主要途径。此外,由CatSper1-4四个主亚基以及多个辅助亚基组成的CatSper通道则是精子膜上介导钙离子内流的首要离子通道,其每个亚基的缺失均将导致雄性小鼠不育。同时,也有多个报道表明人精子CatSper异常将导致男性不育。需要强调的是,KSper与CatSper都是pH依赖的离子通道,即在胞内碱性条件下通道开放。因此,鉴定调控精子pH的关键因子、深入研究其与KSper和CatSper的功能耦联关系,无疑对阐明精子功能调控机制、精确诊断男性不孕不育具有理论与现实意义。在精子中已发现多种调控pH的转运体,其中sNHE是精子特异性表达的钠氢交换器。本实验室已有前期工作表明,sNHE抑制剂DMA导致小鼠精子细胞膜发生去极化,表明sNHE受抑后导致的pH下降减少了KSper的开放,即sNHE与小鼠KSper存在功能耦联。然而,sNHE是否也与CatSper存在功能耦联?sNHE对这些pH敏感的离子通道的作用是否会影响精子功能?更重要的是,在人精子中,sNHE是否与KSper和CatSper也存在功能耦联?基于这些问题,本课题试图系统探索sNHE对精子特异性离子通道KSper、CatSper的调控作用以及对精子功能的影响。实验设计:1、使用钠氢交换器（sNHE）的抑制剂DMA研究在小鼠和人精子中KSper的重要作用。已知KSper的激活会致使大量钾离子的外流,从而导致细胞膜电位超极化,且CatSper通道是pH敏感的通道,受到胞内外pH变化的效应较为明显。利用精子全细胞膜片钳记录技术,来检测sNHE的抑制剂对精子KSper通道和CatSper通道的激活或者抑制,从而说明pH对精子相关通道的影响。2、精子功能及分子实验是检验精子质量和药物效应的有效方法。基于膜片钳的基础,sNHE抑制剂也会用于精子功能及分子实验。以小鼠和人的精子样本作为研究对象,通过计算机辅助精子分析（CASA）、钙信号测量、单细胞钙信号测量、体外顶体反应检测、爬高、免疫荧光反应等体外实验来检测精子功能。实验结果:1、小鼠精子中,当胞内处于pH低缓冲时,细胞外液中加入sNHE抑制剂DMA可显著性导致精子膜电位发生去极化、即KSper开放减少;而当胞内处于pH高缓冲时（即使sNHE受抑制也不会影响胞内pH）,细胞外液中加入sNHE抑制剂DMA不会导致精子膜电位发生去极化。由于上述结果的差异只与胞内pH是否能改变有关,说明DMA对KSper通道的抑制作用是由于抑制了sNHE转运体而不是由于其它非特异原因。此结果进一步证实sNHE与KSper存在功能耦联;2、利用荧光染色和酶标测量DMA对小鼠精子胞内Ca2+的影响,发现DMA显著抑制胞内钙离子浓度;小鼠精子功能实验中,加入DMA后顶体发生率显著降低;3、人精子中,发现sNHE与KSper存在位置上的相似性;选用荧光法测量DMA对胞内pH的影响,实验结果说明DMA同样可以降低人精子胞内pH,单细胞实验中也进一步证实了这一点。而后利用膜片钳方法,检测DMA对KSper本身无抑制的前提下,探究DMA对KSper的效应,结果说明人精子KSper对pH变化的敏感度明显低于小鼠精子KSper,猜测DMA对胞内pH的影响可能不是通过影响KSper而是由于影响了对pH更敏感的CatSper;4、通过酶标仪荧光测量,验证在人精子中,sNHE的抑制剂DMA的确能够降低胞内Ca2+,同时还可显著性地降低由孕酮引起的胞内Ca2+的升高。同样地,在单细胞测量中,胞内Ca2+荧光值由于加入DMA后显著受到抑制,故而进一步验证人精子CatSper因pH的变化而改变胞内Ca2+;5、人精子功能实验中,由于加入DMA后,对精子活力参数、爬高、顶体反应的发生率均有显著影响,推测在人精子中,DMA可通过改变sNHE的作用而间接改变胞内Ca2+,从而使精子功能受到显著影响。膜片钳实验中,加入DMA可降低CatSper的电流和由孕酮激活的钙电流,也充分证实了上述猜想。