辨证论治是中医药不可忽视的诊疗特色,证候是辨证论治的核心内容,是中医临床诊断和治疗的依据。在中医临床研究中,证候疗效评价的客观性、规范性、科学性的问题,一直是影响中医临床评价的关键问题。因此,完善和建立中医证候疗效评价的技术和方法对构建体现中医特色的评价体系有重要的意义。肾阳虚证是临床常见的的证候之一,本研究以肾阳虚证为示范,开展肾阳虚证疗效评价指标的研究。本课题组基于前期研制的《肾阳虚证诊断标准》的相关研究成果,结合国家药品监督管理局颁布《证候类中药新药临床研究技术指导原则》证候评价的相关要求,进一步研究肾阳虚证疗效评价指标。本研究参考《中医药临床试验核心指标集研制技术规范》中研制流程与方法,通过“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”、“医患共评结合”三个维度的混合研究方法,形成肾阳虚证疗效评价指标。并探索性地研究温肾阳药物对代谢组学相关指标的影响和改善,分析温肾阳药物可能的作用通路和疗效指标,为证候疗效评价标准的制定与应用提供思路与方法,为进一步研究肾阳虚证的通路与靶点提供依据。本研究分为两部分。第一部分:采用“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”、“医患共评结合”的研究思路和方法,制定肾阳虚证核心指标集,为证候疗效评价标准的制定提供方法学参考。第二部分:探索温肾阳药物对代谢组学相关指标的影响和改善,从代谢组学层面分析温肾阳药物可能的作用通路和疗效指标,为客观指标的选择提供一些思路。（一）肾阳虚证疗效评价指标的研究1研究目的结合国家药品监督管理局颁布《证候类中药新药临床研究技术指导原则》证候评价的相关要求,参考《中医药临床试验核心指标集研制技术规范》的方法学要求,通过“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”、“医患共评结合”三个维度的混合研究方法,研制肾阳虚证核心指标集,以规范肾阳虚证临床研究疗效评价指标的选择及应用,为《肾阳虚证疗效评价标准》的研究提供基础,同时为证候核心指标集的研究提供思路及方法。2研究方法2.1参考《中医药临床试验核心指标集研制技术规范》的方法学要求,通过文献研究、问卷调查、专家访谈初步构建肾阳虚证的结局指标清单;通过德尔菲法问卷调查筛选核心指标,召开专家共识会议确定肾阳虚证核心指标集。构建“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”的肾阳虚证核心指标集。2.2参考MYMOP量表的模式,对患者着重关心的临床症状加以调查与总结,形成患者疗效自评量表,以构建“医患共评结合”的疗效评价模式。2.3最终,基于三维混合研究方法形成“定性定量研究方法结合、“主客观指标结合、医患共评结合”的肾阳虚证核心指标集,将作为肾阳虚证疗效评价指标。3研究结果3.1文献研究3.1.1肾阳虚证中医症状条目池本研究前期通过文献检索获得肾阳虚证原始症状条目池,经过术语拆分、术语规范过程,进行了专家讨论会,以现场德尔菲与头脑风暴相结合的方法,完成了条目的初步筛选,包括病位条目22条,病性条目15条。3.1.2构建疾病相关肾阳虚证指标条目池初检共获得文献4425篇,根据纳入和排除标准,最终纳入215篇RCTs,包括2篇英文文献。215个RCTs共纳入314个结局指标。将提取的指标名称做规范化、统一化处理,进行归类和分化,形成疾病相关肾阳虚证指标原始条目池,共85个条目,其中频次≥5的16个条目,频次＜5的69个条目,以备下阶段问卷及访谈研究遴选指标。3.2问卷调查及德尔菲法实施3.2.1第一轮患者问卷调查结果第一轮纳入问卷调查的患者,在肾阳虚证症状条目中选择最期待改善的症状,病位条目为:夜尿频、乏力、腹泻。病性条目为:畏寒、手足厥冷。3.2.2第一轮专家问卷及访谈结果3.2.2.1专家问卷各条目结果肾阳虚证中医症状条目池筛选结果:（病位）平均排名前三名为:夜尿频多、腰部酸痛、阳痿,临床意义排名前四为:夜尿频多、阳痿、小便清长、腰部酸痛。计算变异系数（CV）:CV=0.13＜0.25,结果显示专家对条目分歧较小。协调系数（W）:W为0.35,P=0.001＜0.01,结果表明专家协调度较好,评价结论可信性强。（病性）平均排名前三名为:畏寒、五更泻、带下清稀。临床意义排名前三位:畏寒、带下清稀、五更泻。计算变异系数（CV）:CV=0.14＜0.25,结果显示专家对条目分歧较小。协调系数（W）:W为0.27,P=0.004＜0.01,结果表明专家协调度较好,评价结论可信性强。疾病相关肾阳虚证指标原始条目的筛选:频次≥5的指标池中,专家选择频次前三位:性激素指标、生活质量评分、精液参数;频次＜5的指标池中,专家选择频次前三位:甲状腺激素、性生活水平、性功能指标。其他条目:证候评价方法为:个人经验为主,参考已发布的证候疗效评价标准为辅（50%）;临床用药起效时间:“2周”（40%）、“4周”（40%）;用药疗程（使用药物完全控制病情时间）:“8周”（70%）;疗效判定方法:“多个症状（核心指标）消失率/复常率”（60%）;客观指标与证候的严重程度可能相关（80%）。3.2.2.2专家访谈结果针对患者问卷不再分病位及病性,在经过初筛的肾阳虚证中医症状池中进行梳理,合并特点相近症状,删除不足以体现肾阳虚证特点的症状,并将条目进行解释。针对医生问卷,做出以下修改:在肾阳虚证中医症状条目病位中删除尿频,病性中删除神疲,将核心疾病相关指标筛选表中频次＞2及其他补充指标中频次＞2的均纳入核心指标池,将修改好的问卷整理,进行第二轮问卷调查。3.2.3第二轮患者问卷调查结合第一轮问卷及访谈结果,进行第二轮问卷调查,全国范围内纳入100名患者。患者在肾阳虚证中医症状指标池中选择最期待改善的2-5项指标,频次前四位是:夜尿频多、乏力、性欲低下、腰膝酸软。3.2.4第二轮专家问卷调查本轮纳入来自全国范围的100名高级职称专家进行电子问卷调查。积极系数是100%。肾阳虚证中医症状条目池筛选结果:（病位）平均排名前三名为:夜尿频多、腰部酸痛、小便清长,临床意义排名前三为:夜尿频多、腰部酸痛、小便清长。计算变异系数（CV）:CV=0.12＜0.25,结果显示专家对条目分歧较小。协调系数（W）:W为0.25,P＜0.01,结果表明专家协调度较好,评价结论可信性强。（病性）平均排名前三名为:畏寒、五更泻、乏力。临床意义排名前三位:畏寒、五更泻、乏力。计算变异系数（CV）:CV=0.12＜0.25,结果显示专家对条目分歧较小。协调系数（W）:W为0.19,P＜0.01,结果表明专家协调度较好,评价结论可信性强。疾病相关肾阳虚证指标的筛选结果:条目选择超过50%有四个,分别是:生活质量评分（量表形式）（84%）、性生活水平（性生活满意度、性生活日志等）（79%）;性激素指标（60%）;国际勃起功能障碍指数（IIEF-5）量表评分（52%）。其他条目:参考已发布的证候疗效评价标准为主,个人经验为辅（50%）;临床用药起效时间:“2周”（50%）;用药疗程（使用药物完全控制病情时间）:“8周”（46%）;评价方法:“临床控制率（疾病缓解和/或部分缓解和/或病情稳定至少维持4周）”（44%）;客观指标与肾阳虚的严重程度可能相关（56%）;选择以上客观指标及量表作为肾阳虚证疗效判定时必须与疾病相结合（53%）;客观指标与肾阳虚证相关性更大（59%）。根据两轮问卷结果,课题组论证会后,梳理肾阳虚证核心指标,选择频次＞25的15个疾病相关肾阳虚证指标条目、16个肾阳虚证中医症状条目进入下一轮专家共识会议中进行遴选。3.3专家共识会议来自北京、上海、江苏、四川等地的7家三甲医院的临床及方法学的15名高级职称专家进行线上共识会议。共识会议采用名义群体法,由会议秘书引领阅读前期的文献调研结果和德尔菲调查结果,并陈述共识条目。请专家根据结果依次对每个条目进行投票。综合考虑核心指标集的“最简单可行、最重要、标准化、共识性”的原则及评价方法的临床实用性,将超过70%人次投票为4-5分（非常重要）的条目纳入肾阳虚证核心指标集。3.3.1专家共识会议结果肾阳虚证中医症状核心指标:夜尿频多、腰部酸痛、性欲低下、畏寒、乏力、五更泻、精神萎靡。疾病相关肾阳虚证核心指标:生活质量评分、性生活水平。同时专家意见认为:与疾病相关的肾阳虚证指标要界定西医疾病诊断,可作为推荐内容,而不作为肾阳虚证候疗效评价的主体内容。4结论4.1运用“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”的方法,参考《中医药临床试验核心指标集研制技术规范》的制作技术方法与流程,通过文献研究、问卷调查,最后经专家共识会议形成了肾阳虚证核心指标集,包括:肾阳虚证中医症状核心指标7个条目:夜尿频多、腰部酸痛、性欲低下、畏寒、乏力、五更泻、精神萎靡;疾病相关肾阳虚证核心指标2个条目:生活质量评分、性生活水平。肾阳虚证核心指标集以肾阳虚证中医症状核心指标为主要评价指标,采用主要症状与次要症状相结合的评价方式,为肾阳虚疗效评价标准的制定提供参考;与疾病相关肾阳虚证指标需要界定西医疾病诊断,作为推荐内容,不做为肾阳虚证候疗效评价的主体内容。4.2参考MYMOP量表的模式,对患者着重关心的临床症状加以调查与总结,形成基于患者评价疗效的肾阳虚证患者自评量表,共26个条目,以构建“医患共评结合”的疗效评价模式。4.3最终,基于三维混合研究方法初步形成“定性定量研究方法结合、主客观指标结合、医患共评结合”的肾阳虚证疗效评价指标,为下阶段形成肾阳虚证疗效评价量表的形成提供前期工作基础。（二）温肾阳药物人体干预的代谢组学研究1研究目的采用代谢组学的研究方法,探索温肾阳药物在健康受试者中用药前后的代谢过程,观察药物对代谢组学相关指标的影响和改善,从代谢组学角度探索温肾阳药物可能的作用通路和疗效指标,为客观指标的选择提供思路和方法。2研究方法采集中国中医科学院西苑医院一期临床试验病房健康受试者服用附杞固本膏（组成:附子、肉桂、枸杞子）前后的血液及尿液样本,联合采用UPLC/Q-TOF-MS检测方法与非靶向代谢轮廓分析技术,使用Simca 14.1进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）,使用R 4.02进行热图分析,鉴定组间差异生物标志物,并使用MetaboAnalyst 5.0代谢通路分析。3研究结果3.1血样本分析结果3.1.1 PCA分析结果PCA模型参数R2较好,代表模型解释率较好。正离子给药前、药后30min、药后24h三个时间点区分较好。3.1.2 OPLS-DA分析结果OPLS-DA分析发现给药前与给药后24h正负离子药前与药后区分良好。模型参数数据良好,模型稳定可靠。3.1.3差异代谢物鉴定共鉴定出差异代谢物16种,包括LysoPC（溶血磷脂酰胆碱）11种、L-Phenylalanine（苯丙氨酸）、L-Tyrosine（酪氨酸）、Oleic acid（油酸）、Stearic acid（硬脂酸）、Stearoylcarnitine（硬脂酰肉碱）。3.1.4代谢通路分析主要集中于苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢通路、不饱和脂肪酸的生物合成、氨酰基-tRNA的生物合成、泛醌和其他萜类醌的生物合成通路。其中苯丙氨酸与酪氨酸处于苯丙氨酸酪氨酸和色氨酸的生物合成、苯丙氨酸代谢通路、氨酰基-tRNA的生物合成通路。油酸与硬脂酸处于不饱和脂肪酸的生物合成通路,酪氨酸处于泛醌和其他萜类醌的生物合成通路。3.2尿样本分析结果3.2.1 PCA分析结果PCA模型参数R2较好,代表模型解释率较好。正负离子给药前与药后48h时间点区分较好。3.2.2 OPLS-DA分析结果将给药前与给药后48h样本进行OPLS-DA分析,正负离子区分良好。模型参数数据良好,模型稳定可靠。3.2.3差异代谢物鉴定共鉴定出差异代谢物4-Hydroxyproline（羟脯氨酸）、L-Proline（脯氨酸）、Citrulline（瓜氨酸）、Ornithine（鸟氨酸）、L-Leucine（亮氨酸）等19种差异代谢物。3.2.4代谢通路分析主要集中于精氨酸和脯氨酸代谢、精氨酸生物合成、色氨酸代谢通路。羟脯氨酸、脯氨酸、鸟氨酸处于精氨酸和脯氨酸代谢通路中心位置;瓜氨酸、鸟氨酸处于精氨酸生物合成通路;尿嘧啶与5-羟基吲哚乙醛处于色氨酸代谢通路。4研究结论代谢组学结果共发现35个生物标志物及8条通路发生变化,涉及氨基酸代谢、脂肪代谢、能量代谢。以上通路及标记物主要与氧化应激、细胞凋亡、下丘脑-垂体-靶腺轴的功能障碍有关,涉及到心血管疾病、神经退行性疾病及不育症的肾阳虚证型。（三）结论“研究一”运用三维混合研究方法,初步形成“定性定量研究方法结合”、“主客观指标结合”、“医患共评结合”三个维度的肾阳虚证核心指标集,作为肾阳虚证的疗效评价指标。“研究二”开展了温肾阳药物人体干预的代谢组学研究,从差异代谢物的分析来看,此温肾阳药物的作用与“研究一”中性激素水平、性生活水平、精液参数等疾病相关指标密切相关,间接为肾阳虚证核心指标集提供了科学依据及微观物质的补充。但本研究中代谢组学仅为探索性研究,在一定程度上反映出肾阳虚证客观指标的临床应用价值,目的是为进一步研究肾阳虚证的通路与靶点提供参考。