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碱性氨基酸转运载体CAT家族是大部分非上皮细胞膜上介导碱性氨基酸跨膜转运的关键蛋白,现已确定其成员包括CAT-1、CAT-2A、CAT-2B、CAT-3及CAT-4。本试验采用RACE(Rapid amplification of cDNA ends)的方法,首次克隆了猪CAT-2的部分序列,包括3非翻译区(untranslated region,UTR),对其核苷酸全序和氨基酸序列进行合理的预测,并在不同物种间进行同源性比较和结构分析。在此基础上,采用实时荧光定量PCR方法检测了CAT-1和CAT-2 mRNA在不同肌肉组织中的表达水平,研究了1、7、35、60、90,150日龄的长白及蓝塘公猪碱性氨基酸转运载体CAT-1及CAT-2 mRNA在其背最长肌、半腱肌、半膜肌中的发育性表达及差异,以及日粮中添加莱克多巴胺对50kg二元杂大长猪骨骼肌中碱性氨基酸转运载体mRNA表达的影响。
研究结果如下:
1.猪CAT-2基因的cDNA克隆采用RACE方法克隆到猪CAT-2 cDNA的部分序列,GenBank收录号为EF125869。该序列长3028 bp,其中,包括3’非翻译区1088bp。得到的猪CAT-2 cDNA序列与人CAT-2B和鼠CAT-2B的eDNA序列同源性分别为88.1%和84.6%。所得到的猪CAT-2 cDNA与人CAT-2A及人CAT-2B cDNA序列进行比对,同源性分别为84.45和88.1%,初步推测所得到的CAT-2 cDNA序列为CAT-2B基因cDNA序列。预测编码蛋白质分析结果表明,猪CAT-2编码约657个氨基酸残基。根据推测的猪CAT-2 cDNA开放阅读框所预测的氨基酸序列与已知人、大鼠、小鼠、犬、牛、猕猴等真核哺乳动物及两栖类非洲爪蛙的CAT-2氨基酸序列同源性分别为91.9%、92.5%、92.5%、93.8%、93.3%、79.1%和63.2%。推测CAT-2包括14个跨膜区,与人及鼠的CAT-2蛋白跨膜区数量基本一致。
2.长白猪和蓝塘猪骨骼肌CAT-1和CAT-2基因mRNA的表达长白和蓝塘的背最长肌,及蓝塘的半腱肌中,CAT-1 mRNA的表达水平从出生开始至断奶,随日龄增加而升高,断奶后迅速下降,其中7日龄长白猪背最长肌及7日龄蓝塘猪半腱肌CAT-1 mRNA的表达水平显著高于其他日龄。长白猪半腱肌,及长白和蓝塘的半膜肌中,CAT-1 mRNA表达水平从出生开始就有下降趋势,其中1日龄长白猪半腱肌和半膜肌的CAT-1 mRNA水平显著高于其他日龄。长白猪和蓝塘猪背最长肌及半腱肌中,CAT-2 mRNA表达水平从出生1日龄时开始逐渐上升,其中均在90日龄时达到最大值,且显著高于其他日龄,随后有所下降。长白猪半膜肌中,CAT-2 mRNA表达水平从7日龄前呈下降趋势,7日龄后随日龄增加而逐渐上升,在60日龄时达到最大,60日龄后有所回落。蓝塘猪半膜肌中的CAT-2 mRNA表达水平在出生后逐渐上升,在90日龄时达到最大,随后有所下降。CAT-1 mRNA的表达,7日龄两品种猪均以背最长肌中的表达水平最高。90日龄时CAT-2 mRNA的表达,两品种猪均以背最长肌表达丰度最高。 3.日粮添加莱克多巴胺对二元杂长大猪骨骼肌CAT-1、CAT-2 mRNA表达的影响莱克多巴胺对处理组大长猪背最长肌、半腱肌、股二头肌、腰大肌中CAT-1 mRNA表达水平均有下调作用,其中股二头肌中表达丰度显著低于对照组;而对处理组猪的斜方肌及冈上肌中的CAT-1 mRNA表达丰度有上调作用。日粮中添加莱克多巴胺,使处理组猪背最长肌、半腱肌、股二头肌、腰大肌和斜方肌中CAT-2 mRNA表达水平下降,其中背最长肌和股二头肌中表达丰度与对照组相比差异显著。冈上肌中CAT-2 mRNA表达丰度,处理组显著高于对照组。