背景:近年来,外泌体在心肌保护的研究中逐渐受到越来越多的关注。心血管系统是外泌体进行细胞间信号传递的重要场所之一,外泌体介导的心肌细胞间信号传递广泛涉及心血管系统疾病的生理及病理过程。在心肌缺血后,不同细胞来源的外泌体介导的信号传递和组织修复可能发挥着重要作用,其含有的大量与其结构和功能密切相关的物质可通过自分泌或旁分泌的方式作用于自身或远隔的靶细胞,修复受损心肌,对心肌梗死以及心肌缺血再灌注损伤引发的心肌细胞凋亡具有一定保护作用,可能减少梗死面积、增加新生血管数量,从而改善心脏功能。但外泌体如何发挥心肌保护作用的具体机制仍有待进一步研究。本课题研究拟从两部分内容进行阐述:首先从探讨多种来源外泌体在体外循环围手术期的水平变化的角度阐述外泌体与心肌保护之间的关联与作用,然后选取来源广泛且具有多向分化功能的骨髓间充质干细胞来源外泌体,拟从细胞和整体动物两个层面,通过一系列实验,深入研究外泌体介导心肌损伤保护作用的具体机制。第一部分研究多种来源外泌体在体外循环围手术期的表达变化情况目的:探究外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板等多种来源的外泌体在体外循环围手术期的变化情况。方法:选择2017年1月-2017年12月行体外循环下先天性心脏畸形矫治术患儿60例,于体外循环前、再灌注1h、6h、12h、24h、48h、72h分别采集桡动脉血,采用生物素双抗体夹心酶联免疫吸附法(ELISA)检测患儿血浆中c Tn T的浓度水平,并提取桡动脉血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞和血小板,分别采用超速离心法分离内皮细胞、树突状细胞和巨噬细胞来源的外泌体,采用离心法分离血小板来源的外泌体。结果:体外循环再灌注1h、6h、12h、24h、48h c Tn T浓度[(1.352±0.233、1.653±0.231、1.263±0.224、0.623±0.145、0.231±0.025)μg/l]均明显高于体外循环前[(0.013±0.001)μg/l](P<0.05),再灌注1h、6h、12h、24h、48h内皮细胞来源外泌体含量[(167.55±26.67、210.57±31.12、189.56±26.32、142.28±4.27、91.02±3.16)×10~6微粒/ml]均明显高于体外循环前[(76.78±13.14)×10~6微粒/ml](P<0.05),再灌注1h、6h、12h、24h、48h树突状细胞来源外泌体含量[(87.51±6.28、92.12±5.37、83.14±4.29、68.37±3.28、50.49±3.94)×10~6微粒/ml]均明显高于体外循环前[(34.27±4.52)×10~6微粒/ml](P<0.05),再灌注1h、6h、12h、24h、48h巨噬细胞来源外泌体含量[(92.16±2.73、101.26±3.47、88.19±3.20、65.45±2.76、43.28±1.97)×10~6微粒/ml]均明显高于体外循环前[(28.78±2.64)×10~6微粒/ml](P<0.05),再灌注1h、6h、12h、24h、48h血小板来源外泌体含量[(134.27±4.28、141.28±3.06、135.84±3.29、105.61±2.58、65.24±3.10)×10~6微粒/ml]均明显高于体外循环前[(41.51±2.02)×10~6微粒/ml](P<0.05),再灌注72h各指标和体外循环前比较无统计学意义(P>0.05)。结论:外周血内皮细胞、树突状细胞、巨噬细胞、血小板来源的外泌体浓度水平在体外循环围手术期明显增高,且与代表心肌损伤的c Tn T浓度变化一致,证明外泌体具有心肌保护作用。第二部分研究骨髓间充质干细胞来源外泌体调控自噬发挥心肌保护作用机制目的:探讨骨髓间充质干细胞移植对心肌梗死的影响是否与自噬有关,以及外泌体在其中发挥的作用。方法:1.建立小鼠心肌梗死模型,将骨髓间充质干细胞注入梗死周围心肌(4处20μl,共2×10~5个细胞),分别于术后1、3、7、14、28天检测心功能的变化;术后28天取心脏标本,经Masson染色后,比较梗死面积的差异;TUNNEL法检测各组心肌细胞凋亡情况。2.在心肌梗死后1天采集心肌细胞,比较各组心肌组织自噬水平的变化。3.将骨髓间充质干细胞与心肌细胞共培养,在缺氧培养箱中模拟心肌梗死情况,检测心肌细胞自噬水平,并观察使用自噬抑制剂3-MA后的变化情况。4.提取骨髓间充质干细胞来源的外泌体,在缺氧条件下与心肌细胞共培养,检测心肌细胞自噬水平。结果:1.骨髓间充质干细胞移植组术后28天时心功能较心肌梗死组明显改善;骨髓间充质干细胞移植组小鼠心肌梗死面积较心肌梗死组明显减少;骨髓间充质干细胞移植组心肌细胞凋亡率低于心肌梗死组。2.骨髓间充质干细胞移植组LC3-I、LC3-II、p53和BNIP3的表达明显降低。3.缺氧组p53和BNIP3水平升高,骨髓间充质干细胞共培养组p53和BNIP水平降低,使用自噬抑制剂后,心肌细胞死亡率下降。4.骨髓间充质干细胞来源外泌体共培养组LC3-Ⅰ、LC3-Ⅱ、p53和BNIP3在蛋白和m RNA水平上均明显低于缺氧组。结论:骨髓间充质干细胞分泌的外泌体可通过P53/BNIP3信号通路下调心肌细胞自噬水平,减少心肌细胞自噬死亡,从而改善心功能,减少心肌重塑,发挥心肌保护作用。