肿瘤是20世纪以来最难攻克的疾病之一,目前对于肿瘤的研究已经是生命科学领域中的重点、热点以及难点之一,也由此形成了一个专门的学科,肿瘤免疫学。由于免疫系统的复杂性,在肿瘤免疫学的研究中,人们希望能够理解肿瘤的发生发展和清除过程中的每个细节,但是由于肿瘤变异而产生的自身新抗原并不能刺激机体产生有效的免疫响应,因此外源蛋白开始逐渐用于肿瘤免疫学的研究中,这类外源蛋白被称作模型抗原。其中以OVA为代表的模型抗原是目前应用最为广泛的模型抗原之一,它可以让研究者们更好地了解机体肿瘤发生、发展和清除过程中免疫响应的细节,帮助研究者设计出合理的免疫学疫苗或者治疗方案。传统的生物学方法已获得了大量的肿瘤免疫相关的细胞与分子功能信息,然而这些信息尚需要在活体内得到确证。随着活体光学成像技术和荧光蛋白标记方法的发展,对肿瘤细胞和免疫细胞进行多色标记后,可在活体内动态地观察到肿瘤发生发展和清除过程中免疫细胞的运动行为规律。在传统的肿瘤免疫光学成像研究中,往往需要同时引入模型抗原诱导免疫响应以及荧光蛋白作为成像标记分子。如果我们能够发现一种蛋白,不但可以作为模型抗原引起机体产生免疫响应,同时又具有荧光特性适用于活体光学成像,那么这种蛋白将能够在肿瘤免疫光学成像的研究中发挥重要的作用。本研究以一种四聚体的红色荧光蛋白KatushkaS158A为代表,研究了荧光蛋白作为模型抗原的特征验证其诱导机体产生的特异性免疫保护作用,并将其初步应用于肿瘤免疫的活体光学成像中；同时也对KatushkaS158A以及其修饰后的融合抗原在DC疫苗的应用进行了相应的研究,旨在建立起KatushkaS158A为模型抗原的肿瘤免疫学可视化研究模型。具体研究结果如下：1)通过在线软件预测出了KatushkaS158A蛋白中5条候选的H2-Db特异性的抗原多肽,通过RMA-S亲和力实验以及T细胞增殖实验,证实了其中一条多肽TSLQNGCLI是抗原表位多肽。2)体外实验证实了KatushkaS158A蛋白引起的免疫响应。经过KatushkaS158A蛋白免疫处理之后的C57BL/6小鼠中,通过ELISA方法成功地检测到了血清中KatushkaS158A特异性的IgG抗体；抗原免疫的小鼠脾脏细胞中CD8+细胞的比例相对于未刺激组有了一定的升高,而且脾脏细胞在体外再次经过KatushkaS158A抗原刺激后,能够明显地检测到细胞因子IFN-γ的产生。3)利用本实验室已有的稳定表达的B16-KatushkaS158A细胞株,通过荧光成像证实KatushkaS158A的荧光信号不仅可以准确地表征出肿瘤体积的大小变化,而且尾静脉回输模型中也可以发现在小鼠肺部、肝脏以及大脑等器官都出现了明显的转移灶。这些结果表明,本研究成功建立起了基于KatushkaS158A标记的黑色素瘤B16可视化的皮下肿瘤模型以及肿瘤转移模型。通过进一步的活体实验发现KatushkaS158A作为抗原引起机体产生了免疫保护作用。经过KatushkaS158A抗原免疫的小鼠,当皮下接种B16-KatushkaS158A肿瘤细胞株时,相比于对照组,肿瘤的生长明显受到抑制,表明机体成功地产生了KatushkaS158A特异的免疫保护作用。4)成功观察到肿瘤微环境的B16-KatushkaS158A与机体免疫细胞的运动变化。在EGFP-actin表达的转基因小鼠的皮窗模型内接种B16-KatushkaS158A细胞,活体光学成像发现经过KatushkaS158A免疫的小鼠和PBS对照组小鼠的免疫细胞运动规律变化存在着显著性的差异。表明KatushkaS158A作为模型抗原可以用于肿瘤免疫学的活体光学成像研究。5)证实KatushkaS158A抗原以及其偶联B16肿瘤相关抗原肽gp10025-33KVPRNQDWL后的融合抗原gp10025-33-KatushkaS158A-gp10025-33简称Octa-gp100),在制备成DC疫苗后免疫至小鼠体内,明显提高了机体对B16-KatushkaS158A肿瘤的免疫抑制效应,其中融合抗原Octa-gp100效果最为显著。6)成功筛选并获得适用于活体观察的钙离子检测的光学分子探针3xCFP-TnC-cp Venus,在PC12和Hela细胞中的应用表明其相比于已报道的钙探针具有更大的动态范围,为活体肿瘤微环境中的钙信号变化检测提供了重要的研究工具。综上所述,本研究发明了一种荧光模型抗原,可以非常方便地直接用于肿瘤免疫的活体光学成像研究中。荧光蛋白不仅作为荧光标记分子用于成像研究,同时也可以作为模型抗原诱导特异性的免疫响应,从而不再需要其它额外的模型抗原。这样不仅可以简化实验方案,更重要是它充分利用了荧光蛋白的免疫原性,同时也就避免了其它模型抗原需要偶联荧光蛋白标记时所带来的潜在干扰。本研究为肿瘤免疫学相关细胞和分子功能的活体动态研究提供了有价值的工具。