论文部分内容阅读
口蹄疫（foot-and-mouth disease，FMD）是由口蹄疫病毒（FMD virus，FMDV）感染偶蹄类动物所引起的一种急性、热性、高度接触性传染病，目前还没有安全有效的防控措施。实验证明，FMDV野毒株并不感染树突状细胞（Dendritic cells，DCs），但被中和抗体IgG调理的FMDV不仅可以感染DCs，导致其抗原提呈功能丧失，而且还造成DCs大量死亡。当DCs负载灭活FMDV免疫复合物后却能够有效地刺激T细胞，并产生很好的免疫保护。因此，人们开始重视机体对FMDV细胞免疫应答机制的研究。而启动细胞免疫应答需要DCs的抗原提呈，但目前尚未见此类研究报道。本研究通过构建pET32a-VP1-VP4原核表达体系，表达重组VP1-VP4结构蛋白，并进行FITC标记。通过将甘露糖受体（mannose receptor, MR）抑制剂、清道夫受体（scavenger receptor, SR）抑制剂、巨吞饮抑制剂、Hsp90抑制剂、蛋白酶体抑制剂、溶酶体酸化和溶酶体酶抑制剂、循环内体转运抑制剂以不同组合处理骨髓源树突状细胞（BMDCs），再用VP1-VP4负载BMDCs。利用激光共聚焦荧光显微镜、流式细胞术和ELISA等方法检测BMDCs对VP1-VP4摄取、加工与呈递的动力学过程。激光共聚焦显微镜观察发现，在正常组BMDCs，被摄取的VP1-VP4-FITC抗原位于早期内吞小体，并且细胞内抗原的量随着摄取时间增加而增加，形成的内吞小体逐渐增大。抑制巨吞饮后的BMDCs内含VP1-VP4的内吞小体显著减少，说明巨吞饮是BMDCs摄取VP1-VP4的主要方式。而经MR抑制剂或SR抑制剂处理的BMDCs在不同时间出现VP1-VP4抗原摄取量增加的变化，表明MR与SR对VP1-VP4的识别可抑制BMDCs的抗原摄取功能。在经溶酶体酶抑制剂处理的BMDCs，可见VP1-VP4-FITC抗原在溶酶体内的积累，说明溶酶体在抗原的降解过程中发挥重要作用。分别抑制Hsp90或蛋白酶体之后，VP1-VP4抗原在BMDCs内的聚集均显著增加。当同时抑制Hsp90与蛋白酶体后，这种聚集的增加更加显著，甚至形成单一的形态巨大的抗原聚集小泡。这提示Hsp90在将内吞小体中的VP1-VP4转运到细胞质中发挥重要作用。用VP1-VP4负载BMDCs，并与淋巴结T细胞共培养，然后用流式细胞仪对BMDCs进行检测，结果显示BMDCs表面MHC II表达量升高，CD11c的表达量略有减少，表明VP1-VP4可以活化BMDCs。抑制溶酶体酶的活性之后，MHC II表达量变化较小，但是CD11c表达水平降低。抑制循环内体的转运功能之后，MHC II的表达显著升高，几乎呈全阳性表达，在同时抑制循环内体与溶酶体的BMDCs，MHCII表达量更高，同时CD11c的表达也明显升高，但不同处理组BMDCs的CD80表达水平都非常低，这提示BMDCs还可能存在其他降解VP1-VP4抗原的机制。用ELISA检测发现，负载VP1-VP4抗原的BMDCs与T细胞共培养的上清液中含有大量的IFN-γ和IL-17，而IL-4和TGF-β1的含量极低。无论抑制Hsp90、蛋白酶体，还是溶酶体，都会引起IFN-γ水平极显著降低（P<0.01），证明Hsp90、蛋白酶体和溶酶体在FMDV VP1-VP4抗原加工过程中发挥非常重要的作用。值得注意的是，小剂量Hsp90抑制剂组（200nmol/mL）产生IFN-γ的量高于大剂量组（1μmol/mL），在各个时间点均有极显著差异（P<0.01），并且Hsp90抑制剂与蛋白酶体抑制剂同时使用后表现相同的趋势。但是大剂量Hsp90抑制剂（1μmol/mL）与蛋白酶体抑制剂同时使用组产生IFN-γ的量高于单独使用Hsp90抑制剂组，而小剂量Hsp90抑制剂（200nmol/mL）与蛋白酶体抑制剂同时使用组产生IFN-γ的量低于单独使用Hsp90抑制剂组。推测当Hsp90被高度抑制之后，保存完好的抗原表位可以通过溶酶体途径进行提呈，产生较高水平的IFN-γ。Primaquine能阻断内吞小体重返细胞膜的过程。在抑制蛋白酶体的前提下，用大剂量Primaquine（100nmol/mL）处理的BMDCs刺激T细胞产生IFN-γ的量远远低于小剂量组（50nmol/mL），这表明交叉提呈途径在BMDCs提呈VP1-VP4抗原的过程中起着非常重要的作用。通过对IL-17的检测发现，IL-17的含量都非常高（含Chloroquine的处理组除外），并且迅速达到释放量的峰值（48h之内），72和96h各处理组所产生IL-17的量没有显著差异（P＞0.05），并且各处理组IL-17检测水平与本组对应时间点上IFN-γ的释放趋势保持一致。值得注意的是，IFN-γ的浓度在96h内呈现持续升高的变化趋势，而IL-17在48h内达到峰值。从以上结果可以得出结论：BMDCs主要通过巨吞饮的方式摄取VP1-VP4抗原，在细胞内形成包裹VP1-VP4的内吞小体，后者与溶酶体融合，VP1-VP4由此被降解，产生的抗原表位与MHC II分子结合，提呈给CD4+T细胞。内吞小体中的VP1-VP4也可被Hsp90转运到细胞质基质中被蛋白酶体降解，产生的抗原表位被MHC I分子交叉提呈给CD8+T细胞。内吞小体也可通过再循环机制将VP1-VP4提呈给T细胞。被激活的T细胞释放大量的IFN-γ和IL-17。