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防御素是哺乳动物先天免疫的重要组成部分,近些年的研究发现防御素具有抗菌活性、促炎抗炎、适应性免疫等多种生物学功能,既具有开发成抗生素替代品的潜力,又可以作为提高抗病力的药物靶点。2012年通过对猪的基因组比对分析发现了猪βdefensin 114（PBD114）,目前为止PBD114的表达调控机制,生物学功能及其机制尚未有报道。因此本研究开展五个试验,首先克隆并分析了PBD114基因序列,比较了不同品种猪PBD114基因表达的差异,探索了PBD114的表达调控机制;在此基础上,成功表达出PBD114蛋白,并以小鼠和IPEC-J2细胞为模型,研究了PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用和机制。主要研究结果如下:试验一PBD114基因的克隆、序列分析及其在不同品种猪间的差异表达藏猪是西藏和川西地区特有的猪种之一,与外种猪相比,具有耐粗饲和抗病力强的优点。本试验分别以藏猪和DLY猪的cDNA为模板,克隆了藏猪和DLY猪PBD114基因CDS序列,用DNAMAN比对分析,且分析了猪、人、大猩猩和瘤牛的βdefensin114的氨基酸序列。结果表明:藏猪和DLY猪的PBD114基因CDS区序列完全一致,猪、人、大猩猩和瘤牛的beta defenisn 114同源性比较近;为研究PBD114在不同品种猪间的表达规律,选取6头60日龄藏猪（6.63±0.85 kg）和6头60日龄DLY三元仔猪（21.72±0.36 kg）,检测PBD114在猪的组织中表达丰度。结果表明:PBD114在DLY猪的十二指肠中表达丰度最高,在藏猪的空肠中表达丰度最高。藏猪的空肠、结肠和肺中的PBD114表达丰度显著高于DLY猪（P<0.05）,然而藏猪的肾脏中PBD114表达丰度显著低于DLY猪（P<0.05）。上述结果表明:Beta defensin 114在不同品种和物种间高度保守,藏猪各组织PBD114表达水平普遍高于DLY猪,提示PBD114可能在猪的健康与免疫调节方面发挥了重要作用,是潜在的抗病基因之一。试验二PBD114基因的表达调控机制研究为探索PBD114在免疫调节中的作用,分别以7日龄DLY仔猪和IPEC-J2为体内外模型,用E.coli K88作为病原菌进行攻毒,研究PBD114基因在免疫激活下的表达规律,结果表明:E.coli K88显著提高了猪十二指肠、空肠和回肠PBD114基因的表达量（P<0.05）以及IPEC-J2的PBD114基因的表达量（P<0.05）,说明PBD114在免疫激活下上调。由于TLRs是介导免疫激活的重要病原菌受体,为探索PBD114的表达受何种信号途径的调控,进一步采用不同的TLRs激活剂Pam3CSK4、Poly（I:C）、LPS、R837（分别为TLR2、3、4和7激活剂）处理IPEC-J2细胞。结果发现:Pam3CSK4显著降低PBD114基因的表达量（P<0.05）;Poly（I:C）、LPS和Imiquimod-R837均显著提高PBD114基因的表达量（P<0.05）。该结果表明,TLR2/3/4/7参与PBD114的表达;TLRs途径的下游是NF-κB和MAPK信号途径,而基因的表达是由转录因子调控。在此基础上,利用JASPAR在线预测发现转录因子NF-κBp65（RELA）和AP-1（FOS和JUN）能够结合PBD114上游启动子区,通过双荧光素酶报告试验证实,转录因子RELA、FOS和JUN均参与了PBD114转录激活,其调控强度为:RELA-JUN>RELA>RELA-FOS>FOS>JUN>FOS-JUN。另外IPEC-J2细胞在E.coli K88攻击下,PBD114基因表达显著提高（P<0.05）,但RELA抑制剂PDTC可显著抑制PBD114基因表达（P<0.05）,结果进一步表明PBD114基因表达受RELA的调控。上述结果表明:免疫激活（如E.coli K88攻击）可上调猪PBD114基因表达,TLR2/3/4/7信号途径均参与了PBD114基因表达的调控,其中,转录因子RELA、FOS和JUN对PBD114的基因表达起关键调节作用。试验三PBD114在大肠杆菌中的异源表达及其生物学特性研究为进一步研究PBD114的生物学特性及功能,将PBD114的成熟肽的DNA构建到表达载体pET32（a+）中,并转化到表达宿主菌Origami B（DE3）构建重组表达菌Origami B-pET32-PBD114,以获得重组PBD114蛋白。通过最优表达条件(最佳表达初始OD600值为0.6、0.8和1.0,最佳IPTG诱导浓度是0.5和1.0 mM,最佳诱导时间是4、6、8和10 h)、亲和层析纯化和蛋白质谱鉴定,成功获得纯度达到95%以上的重组PBD114（rPBD114）,且蛋白质谱结果表明rPBD114的氨基酸序列和NCBI数据库中NP001123445重合度达到100%。在线分析PBD114的蛋白结构和物理化学特性,PBD114同人的beta-defensin 2相似,具有α螺旋和β折叠组成的蛋白结构,带有+1电荷的具有双亲性的多肽。体外抑菌试验表明,rPBD114对E.coli DH5α和E.coli K88+均有较明显的抑制作用,MIC值分别为64和128μg/mL;红细胞溶血与细胞毒性试验则证实,rPBD114几乎没有溶血性和细胞毒性,表明rPBD114安全性较好,可用于后续体内外研究。试验四PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制肠上皮细胞炎性损伤是导致肠道屏障功能受损的重要原因之一,前面的研究结果已经证实PBD114在免疫激活下表达量显著提高,但其有怎样的免疫调节功能及其调控机制如何。本试验采用双因素设计,先用rPBD114和抑制剂PDTC（抑制NF-κB）、GDC-0994（抑制ERK1/2）和T-5224（抑制FOS）预处理IPEC-J2细胞1 h,再分别用PBS和LPS处理细胞3 h,以此探究PBD114缓解肠上皮细胞炎性损伤的作用及其机制,结果表明:rPBD114和抑制剂显著提高LPS引起的IPEC-J2细胞活性的降低（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显著提高ZO-1、claudin-1和occludin的基因表达量（P<0.05）,显著提高ZO-1和claudin-1蛋白表达（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显著降低TNFα、IL-1β和IL-6的基因表达量（P<0.05）,显著降低细胞培养液TNFα和IL-1β蛋白浓度（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显著降低LPS引起的IPEC-J2早期凋亡、晚期凋亡和总凋亡的提高（P<0.05）,显著增加IPEC-J2的Bcl-2的基因表达量（P<0.05）,显著提高IPEC-J2的Bcl-2/Bax（P<0.05）。显著降低IPEC-J2的Bax的基因表达量（P<0.05）,显著降低caspase 8和caspase 9的蛋白水平（P<0.05）。rPBD114和抑制剂显著降低LPS诱导的IPEC-J2细胞pIκB-α/IκB-α、pNF-κB/NF-κB和pERK1/2/ERK1/2的升高（P<0.05）。上述结果表明:rPBD114可通过降低NF-κB和ERK信号通路关键分子IκB-α、NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,减少肠上皮细胞炎性因子表达,进而下调凋亡相关基因和蛋白表达水平,减少肠上皮细胞凋亡。试验五PBD114对LPS诱导小鼠肠道屏障炎性损伤的缓解作用为进一步验证PBD114在缓解肠道屏障炎性损伤中的作用效果,试验将72只3周龄ICR小鼠按照体重相近原则,随机分配到6个试验组:CON（生理盐水）、LOW（4 mg/kg的rPBD114）、HIGH（8 mg/kg的rPBD114）、LPS（生理盐水+10 mg/kg LPS攻毒）、LOW+LPS（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）和HIGH（4 mg/kg的rPBD114+10 mg/kg LPS攻毒）。预饲一周后,按照试验设计所有试验鼠注射给与等体积的rPBD114或生理盐水,每天注射一次,连续注射6天。试验第7天早上小鼠注射完生理盐水和rPBD114后1 h,攻毒组立即注射10 mg/kg LPS,未攻毒组注射等体积的生理盐水,5 h后所有小鼠二氧化碳麻醉处死。结果表明:LOW组显著降低采食量和平均日采食量（P<0.05）,增加脾脏的脏器指数（P<0.05）;LPS攻毒显著增加血清D乳酸和二胺氧化酶的水平（P<0.05）,表明LPS攻毒模型成功导致小鼠肠道炎性损伤;LPS攻毒增加炎性因子的基因和蛋白水平,造成小鼠肝脏、肾脏和肠道屏障的损伤;而给与小鼠rPBD114,可降低血清和空肠的炎性因子（TNFα、IL-1β和IL-6）水平（P<0.05）,减少LPS对小鼠肝脏（降低血清ALT）的损伤（P<0.05）,并且通过调节空肠凋亡相关基因（增加Bcl-2和Bcl-2/Bax的基因表达,降低Bax和caspase3的基因表达）的表达（P<0.05）,提高肠道紧密连接蛋白（增加ZO-1、occludin和claudin-1的基因表达,增加ZO-1蛋白表达）表达（P<0.05）,增强机体免疫力（提高血清IgG、IgM、C3和C4）（P<0.05）,从而改善肠道形态（降低十二指肠隐窝深度和提高空肠的绒隐比）（P<0.05）。上述研究结果表明:LPS攻毒造成小鼠全身性炎症和肠道损伤。rPBD114在不影响小鼠生长性能的前提下,通过降低血清和空肠中炎症因子的产生,调节凋亡相关基因和蛋白的表达,减少肠黏膜凋亡,提高小鼠免疫力,改善肠道健康。综上所述,PBD114在不同品种猪之间高度保守,且PBD114在藏猪的组织中表达水平高于DLY猪,PBD114在免疫激活下表达上调,是一个重要的免疫应答基因,其表达受TLR2/3/4/7和转录因子RELA/FOS/JUN调控;PBD114不仅具有抑菌活性,且对免疫激活具有明显的反馈调节作用,即在免疫激活时,PBD114通过降低IκBα,NF-κB和ERK1/2磷酸化水平,抑制炎性因子表达,缓解其导致的肠上皮细胞炎性损伤。上述研究结果不仅从理论上揭示了PBD114的表达调控机制及其生物学功能,还有望为新型抗生素替代品的研发以及寻求改善动物健康的营养调控措施等提供新的思路。