论文部分内容阅读
目的:2020年全球癌症数据显示,胃癌的发病率全球第五,死亡率居于全球第四,且面临严重的预后及耐药困扰。盐霉素（SAL）是一种广谱抗菌药物,亦具有抗肿瘤特性,特别是盐霉素与化疗或放疗联合使用的协同效应是一个值得探讨的问题。目前SAL如何影响耐顺铂胃癌细胞的增殖、迁移、侵袭、凋亡,以及如何逆转癌细胞放疗抵抗及多重耐药,其机制尚不清楚,盐霉素能否对耐顺铂胃癌细胞产生较好的增敏作用目前未见报道。基于此,本实验将盐霉素（SAL）和顺铂（DDP）作用于人胃粘膜上皮细胞GES-1、胃癌细胞SGC-7901、耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP,确定盐霉素是否能在体外提高耐顺铂胃癌细胞SGC-7901/DDP对顺铂化疗的敏感性。同时初步探究盐霉素与顺铂联合作用的分子机制及盐霉素对耐顺铂胃癌细胞的增敏机制,从而为改善顺铂耐药和胃癌的治疗新方案的提出提供理论依据,为临床应用提供新的思路。方法:1.CCK-8法检测SAL对SGC-7901、SGC-7901/DDP细胞活力的影响,筛选SAL与DDP单药及联合应用的最佳浓度。2.CCK-8、Transwell及细胞划痕实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞增殖、侵袭、迁移的影响,CCK-8法同时检测SAL对GES-1细胞增殖的影响。3.流式细胞术检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞周期及凋亡的影响。4.免疫印迹实验及免疫组化实验检测SAL与DDP单药及联合应用对SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞凋亡相关因子Bcl-2、Bax、Caspase 3、Caspase 9、Fas-L、NF-κBp65表达的影响,探究SAL诱导凋亡的可能机制。5.免疫印迹实验检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin与靶基因Axin2和CCND1、EMT标记蛋白E-cadherin、N-cadherin和Vimentin的表达;免疫荧光检测SAL、SAL与Wnt-C59联合处理SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞后β-catenin的核定位;探究SAL作用于SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞的化疗增敏机制。结果:1.CCK-8法筛选出SAL-8μM与DDP-3μg/m L作用24 h为最佳作用浓度和时间。2.SAL-8μM作用于GES-1细胞24 h抑制率与对照组（0μM）比较差异无统计学意义（P>0.05）;与对照组比较,SAL与DDP分别处理SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞24 h均能显著降低两种细胞的的增殖、侵袭和迁移能力,并显著增加细胞凋亡率（P<0.01）;其中在SGC-7901细胞中,与SAL组相比,DDP组、双药组均显著降低SGC-7901细胞的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显著增加细胞凋亡率（P<0.05）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显著降低SGC-7901/DDP的增殖能力（P<0.05）、侵袭能力（P<0.05）、迁移能力（P<0.05）并显著增加细胞凋亡率（P<0.05）。3.在SGC-7901和SGC-7901/DDP细胞中,DDP处理组中G0/G1期细胞比例均显著高于对照组和SAL组（P<0.01）;同时,SAL处理组中S期细胞比例均显著高于对照组和DDP组（P<0.01）。4.与对照组比较,SAL和DDP分别处理24 h后,SGC-7901和SGC-7901/DDP两种细胞中Caspase 3、Caspase 9、Bax的表达量均显著上调（P<0.01）且Bcl-2的表达量均显著下调（P<0.01）;且与单药组相比,双药联合组表达量变化量更明显（P<0.01）;在SGC-7901/DDP细胞中,与DDP组相比,SAL组、双药联合组均显著升高Caspase 3、Caspase 9、Bax表达水平（P<0.01）。5.在SGC-7901细胞中,与对照组比较,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,但是DDP组中Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达更明显,双药联合使用未见明显的协同作用;在SGC-7901/DDP细胞中,SAL及DDP分别处理均增加了Fas-L、细胞质中NF-κBp65的表达,双药联合使用表现出协同作用。6.在SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞中,与对照组比较,SAL处理组N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1蛋白表达量均降低（P<0.01）,而E-cadherin的表达量增高（P<0.01）,β-catenin的核外移增多;与SAL组相比,SAL与Wnt-C59联合处理组两种胃癌细胞中N-cadherin和Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）及β-catenin、Axin2和CCND1的表达量进一步下调（P<0.01）,E-cadherin的含量进一步上调（P<0.01）,β-catenin的细胞核外移进一步增多。7.与SGC-7901比较,SGC-7901/DDP耐药株SAL处理组、SAL与Wnt-C59联合处理组,N-cadherin、Vimentin、p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin、Axin2、CCND1表达的下调和E-cadherin的上调及β-catenin的核外移程度均增强。结论:1.SAL-8μM作用24 h对人胃粘膜上皮细胞GES-1细胞的无明显抑制作用,但可以抑制胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP的增殖。2.SAL与DDP均能抑制SGC-7901及SGC-7901/DDP细胞的增殖、侵袭、迁移和诱导凋亡,SAL可调节并增强DDP对胃癌细胞SGC-7901及顺铂耐药细胞SGC-7901/DDP增殖、侵袭、迁移的抑制作用和诱导凋亡作用,两药联合具有协同作用;与SGC-7901不同,SAL、双药联合均比DDP对SGC-7901/DDP迁移抑制、诱导凋亡作用更强。3.DDP可致胃癌细胞SGC-7901、SGC-7901/DDP周期阻滞于G0/G1期,SAL可阻滞于S期,两药可分别作用于不同周期时间点发挥细胞阻滞作用。4.SAL与DDP通过Fas-L通路,上调凋亡相关因子Caspase 3、Caspase 9、Bax、Fas-L并下调Bcl-2的表达,同时抑制核内NF-κBp65的表达来调节胃癌细胞SGC-7901及SGC-7901/DDP凋亡,且仅在SGC-7901/DDP中,两药具有明显协同作用。5.SAL通过下调Wnt/β-catenin通路效应物p-GSK-3β（Ser9）、β-catenin及靶蛋白Axin2和CCND1等的表达抑制EMT进程,从而抑制肿瘤细胞的侵袭迁移,增加肿瘤细胞对DDP的敏感性,逆转耐药细胞耐药抵抗。