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本研究一共探讨了四种检测核酸的新技术,其中包含两种滚环扩增检测方法和两种PCR检测方法。结合滚环扩增和近红外荧光等技术,开发了两种滚环扩增检测技术。将CRISPR基因编辑应用到PCR技术中,从而发展了两种CRISPR辅助PCR检测技术。1.NM-NIRF-spRCA核酸检测技术通过静电吸附和紫外交联,带正电荷的尼龙膜(Nylon membrane,NM)可以简单方便地固定核酸分子。因此,它是一种常用于核酸检测的固相载体。滚环扩增(Rolling circle amplification,RCA)是广泛用于核酸检测的等温DNA扩增技术。近红外荧光(Near infrared fluorescence,NIRF)是一种新的荧光技术,具有背景低、信噪比高、灵敏度高等优点。本章将NM、RCA和NIRF等材料及技术相结合,开发了一种在尼龙膜上检测核酸的简单方法,命名为基于近红外荧光的尼龙膜固相滚环扩增技术(NM-NIRF-spRCA)。该方法只需要两种核酸分子:滚环(RC)和3′末端带有RCA引物的靶特异性探针(-PP)。检测程序由四个步骤组成:(ⅰ)通过紫外交联将靶核酸固定在NM上;(ⅱ)RC和NM上固定的靶核酸与特异性探针杂交;(ⅲ)进行含有Biotin-dUTP的RCA扩增;(ⅳ)用NIRF标记的链霉亲和素温育NM并用NIRF成像仪成像。通过检测寡核苷酸、质粒中的各种HPV亚型的L1片段和大肠杆菌基因组DNA,充分验证了该方法。因此该研究为检测核酸分子提供了一种新的简便方法。2.SLP-RCA核酸检测技术本章介绍了一种使用茎环引物(Stem-loop primer,SLP)进行滚环扩增的新技术。该技术能够在固相和液相中通过线性或超分支滚环扩增(SLP-1RCA或SLP-HRCA)检测靶DNA。对于固相检测,SLP-HRCA分四步检测核酸:(ⅰ)将各种捕获探针(Capture probe,CP)共价结合在固相载体上形成CP阵列;(ⅱ)将CP阵列与DNA样品杂交;(ⅲ)用含有SLP1、SLP2和Biotin-dUTP的反应液在CP阵列上进行RCA反应;(ⅳ)将CP阵列成像。在液相中,SLP-HRCA检测核酸只需一步:进行包含DNA样品、SLP1和SLP2的实时RCA反应。液相和固相检测都采用通用的滚环模板、SLP2和特异于靶DNA的SLP1。在液相和固相上通过检测寡核苷酸和六种不同的人乳头瘤病毒(Human papillomavirus,HPV),初步验证了该技术。还在宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)和临床样品中检测到了两种高危型HPV(HPV16和HPV18),这充分验证了该技术的可行性。本研究为RCA核酸检测提供了新的途径。3.Cas9/sgRNA辅助反向PCR核酸检测技术本章开发了一种基于Cas9核酸酶检测靶DNA的新方法,该方法被命名为CARP(Cas9/sgRNA-assistant reverse PCR)即Cas9/sgRNA辅助反向PCR。该技术可以简单、快捷、特异和灵敏地检测靶DNA。该技术分三步来检测靶DNA:(ⅰ)Cas9与一对特异的sgRNA结合后切割靶DNA;(ⅱ)用DNA连接酶连接切割产物;(ⅲ)用PCR扩增靶DNA。在连接步骤中,Cas9切割的靶DNA可以在分子内连接成环状或在分子间连接成线形DNA。最后用一对反向引物通过PCR扩增连接产物。通过在9种不同人乳头状瘤病毒(HPV)亚型中检测HPV16和HPV18 L1基因验证了该技术。该技术还在两个HPV阳性宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)的基因组DNA中检测到了两个高危型HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV阴性宫颈癌细胞C-33a中没有检测到这两个基因。通过这些概念验证,本研究提供了一种新的基于CRISPR的DNA检测和分型的方法。特别是本研究验证的CARP方法已进行了HPV临床检测,成功地检测了一批临床样品。4.CRISPR分型PCR核酸检测技术本章发展了一种利用CRISPR技术检测目标DNA的新方法,即CRISPR或Cas9/sgRNA分型PCR(CRISPR-or Cas9/sgRNA-typing PCR,ctPCR)。该技术检测目标DNA只需一步反应:用荧光定量PCR(qPCR)扩增检测Cas9/sgRNA切割后的DNA样品。直接在qPCR反应程序之前额外加一段恒温孵育时间,使Cas9/sgRNA切割反应合并到qPCR反应中。这样就可以用仅仅2个小时的时间来均相检测目标DNA。在整个检测过程中无需打开检测管,ctPCR的全部检测过程可以通过常用的核酸检测设备(荧光定量PCR仪)在较短的时间内完成。通过检测十种不同的人乳头瘤病毒(HPV)亚型的L1基因验证了该技术。该技术在两种HPV阳性宫颈癌细胞(HeLa和SiHa)中成功地检测了两种高危HPV(HPV16和HPV18)的L1和E6-E7基因,在HPV阴性的宫颈癌细胞中没有检测到HPV的L1和E6-E7基因。最后,通过检测临床样品中的HPV进一步验证了ctPCR方法。因此,本研究提供了一种基于CRISPR的检测和分型DNA的新方法。