高血糖是糖尿病主要标志及病理生理学基础。糖尿病心肌病是糖尿病心血管并发症之一，糖尿病心肌病患者心肌损伤主要来源于心肌细胞及心肌间质细胞两方面，过去人们对于心肌细胞损伤的研究较多，近年来越来越多的研究发现心肌间质的纤维化在糖尿病心肌病发生、发展中也起着不可忽视的作用。心肌间质重构及纤维化是糖尿病心肌病的特征性病理表现。现代研究表明，内脏脂肪组织作为最重要的内分泌器官，其分泌的多种细胞因子如C-反应蛋白（C-reactive protein，CRP）、肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-α， TNF-α）、白介素-6（interleukin-6，IL-6）和脂联素、抵抗素及瘦素等与动脉粥样硬化、冠心病、高血压及糖尿病等肥胖相关性疾病病变程度密切相关。Visfatin是2005年新发现的一种脂肪细胞因子，因其最初是在内脏脂肪细胞发现的，故命名为内脂素，随后的研究发现Visfatin与前β细胞克隆增强因子(pre-β cell colony-enhancing factor，PBEF)基因的5’非编码区序列相同。而且与烟酰胺腺嘌吟二核苷酸(NAD)合成的限速酶，即尼克酰胺磷酸核糖转移酶(NamP)结构也相同。Visfatin不仅在人类脂肪组织、白细胞表达，还在人和动物肝细胞、肌肉组织及肾脏中表达，并发挥不同的生物活性效应。可影响心血管疾病、内皮功能障碍、胰岛素抵抗、糖尿病等发生发展的进程。Visfatin具有类胰岛素效应，还能促进脂肪细胞分化、抑制细胞凋亡，促进细胞成熟、增殖，促炎等。有研究发现，Visfatin作为生长刺激因子，其可能像脂连素、瘦素一样，可由心脏本身生成，并反馈作用于心脏，发挥类胰岛素效应、炎症因子、促增殖、抗凋亡等作用。但目前关于心脏细胞表达visfatin的研究极少，糖尿病心肌病作为糖尿病心血管主要并发症之一，迄今国内外尚未见高糖环境中心脏细胞表达、合成的visfatin相关研究报道。本研究以高浓度葡萄糖作用于新生Sprague-Dawley（SD）大鼠心肌细胞及心脏成纤维细胞，探讨visfatin在高糖作用下的乳鼠心肌细胞及心脏成纤维细胞中的表达情况，并对其表达调节及对心肌纤维化的相关影响进行了初步探讨。为临床治疗糖尿病，降低糖尿病的心肌损害，提供重要的理论依据和指导，为糖尿病心肌病提供新的治疗靶点。第一部分MAPK信号转导通路对高糖诱导下新生大鼠心肌细胞中Visfatin表达的调节目的：离体条件下应用不同浓度，不同时间葡萄糖干预新生SD大鼠心肌细胞，观察Visfatin表达情况，探讨不同MAPK信号转导通路对高糖刺激下Visfatin表达的调节作用。方法：提取、培养新生SD大鼠心肌细胞，⑴不同浓度葡萄糖干预，检测心肌细胞visfatin表达：设对照组葡萄糖5.5mmol/L；高糖10mmol/L组；高糖30mmol/L组；高糖50mmol/L组；高渗对照组(5.5mmol/L葡萄糖+44.5mmol/L甘露醇)。⑵同一浓度葡萄糖在不同时间干预，检测心肌细胞visfatin表达：设对照组葡萄糖5.5mmol/L；高糖30mmol/L6h刺激组；12h刺激组；24h刺激组；48h刺激组。⑶不同信号转导通路抑制剂干预，检测心肌细胞visfatin表达变化：设对照组（葡萄糖5.5mmol/L）；高糖30mmol/L组；高糖30mmol/L+ERK1/2抑制剂(PD98059)组；高糖30mmol/L+JNK抑制剂(SP600125)组；高糖30mmol/L+P38MAPK抑制剂(SB203580)组。应用MTT法检测心肌细胞活性；RT-PCR法测定心肌细胞visfatin-mRNA表达；Western blot检测visfatin蛋白质的表达。结果：1不同浓度葡萄糖对于心肌细胞Visfatin-mRNA/protein表达的影响：⑴从MTT结果示:以不同浓度(5.5mmol/L,10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激48小时，随葡萄糖浓度的增加，吸光度值呈剂量依赖性增加，50mmo1/L时达峰，10、30、50mmol/L各组与对照组相比， P<0.01均有显著统计学差异。⑵在不同浓度(10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激下，除高渗组外，10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L各组与5.5mmol/L对照组相比，visfatin-mRNA表达均增加，P<0.01有显著统计学差异。10mmol/L,30mmol/L葡萄糖刺激下，心肌细胞visfatin-mRNA的表达随浓度增加呈剂量依赖性增加，而浓度50mmol/L组表达Visfatin-mRNA较30mmol/L组有所减少，但两组间相比，无统计学差异；⑶在不同浓度(10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激下Visfatin蛋白质表达较对照组均增加，P<0.01有显著统计学差异，其中30mmol/L组蛋白质表达最多，50mmol/L组较30mmol/L组减少，P<0.05有统计学差异。高渗组的Visfatin-protein表达低于5.5mmol/L组，且统计学比较有显著性差异(P<0.05)。这些结果提示：在一定范围内，高糖引起心肌细胞表达Visfatin呈浓度依赖性增加，且这一作用与高糖引起的高渗环境无关。2高糖（30mmol/L）在不同时间刺激对于心肌细胞Visfatin-mRNA/protein表达的影响：⑴从MTT结果示:30mmol/L葡萄糖不同时间（6、12、24、48小时）刺激下，各组吸光度值较对照组均显著增加，P<0.01有统计学差异；24小时内随刺激时间的增加，吸光度值呈时间依赖性增加，24小时达峰，48小时后开始降低，且与24h组相比有统计学差异，P<0.05。⑵应用30mmol/L葡萄糖不同时间（6、12、24、48小时）刺激下，各组Visfatin-mRNA/protein表达均较对照组显著增加，P<0.05有统计学差异；24小时内随刺激时间的增加，呈时间依赖性增加，24小时达峰，48小时后表达有所降低，但与24h组相比无显著统计学差异。这些结果提示：在一定时间范围内，随高浓度葡萄糖作用时间的延长，心肌细胞Visfatin的表达升高。3MAPK信号转导通路对高糖（30mmol/L）刺激下心肌细胞Visfatin-mRNA/protein表达的调节：不同MAPK信号信号转导通路抑制剂干预后，与对照组（葡萄糖5.5mmol/L）相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+PD98059组、高糖30mmol/L+SP600125组、高糖30mmol/L+SB203580组的Visfatin-mRNA/protein表达均较对照组增加，P<0.01有显著统计学差异。但高糖30mmol/L+SB203580组的Visfatin-mRNA/protein表达较高糖30mmol/L组显著降低，P<0.05有统计学差异。高糖30mmol/L+PD98059组、高糖30mmol/L+SP600125组与高糖30mmol/L组相比，无显著统计学差异。这些结果提示：SB203580抑制了高糖诱导的心肌细胞Visfatin的表达。结论：高糖刺激心肌细胞合成Visfatin，且在一定时间、浓度范围内，呈浓度-时间依赖性表达增加。P38MAPK信号转导通路参与介导了高糖环境中心肌细胞Visfatin的合成。第二部Rho/ROCK信号转导通路对高糖诱导下新生大鼠心脏成纤维细胞中Visfatin及Ⅰ型胶原表达的调节目的：离体条件下应用不同浓度，不同时间葡萄糖干预新生SD大鼠心脏成纤维细胞，观察Visfatin及Ⅰ型前胶原表达情况，探讨Rho/ROCK信号转导通路对高糖刺激下Visfatin及Ⅰ型胶原表达的调节作用。方法：提取、培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞，⑴不同浓度葡萄糖孵育干预，检测心脏成纤维细胞visfatin及Ⅰ型前胶原表达：设对照组葡萄糖5.5mmol/L；高糖10mmol/L组；高糖30mmol/L组；高糖50mmol/L组；高渗对照组(5.5mmol/L葡萄糖+44.5mmol/L甘露醇)。⑵同一浓度葡萄糖在不同时间干预，检测心脏成纤维细胞visfatin及Ⅰ型前胶原表达：设葡萄糖5.5mmol/L对照组；高糖30mmol/L6h刺激组；12h刺激组；24h刺激组；48h刺激组。⑶Rho/ROCK信号转导通路对Ⅰ型前胶原、Visfatin和ROCK1的表达调节：设对照组（葡萄糖5.5mmol/L）；高糖30mmol/L组；低糖5.5mmol/L+Y27632(10μmol/L)组；高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组。应用MTT法测定心脏成纤维细胞的增殖；Real time-PCR法测定心脏成纤维细胞visfatin、Ⅰ型前胶原-mRNA表达；Western blot检测visfatin、Ⅰ型前胶原、ROCK1蛋白质的表达。结果：1不同浓度葡萄糖对于心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原及Visfatin-mRNA/protein表达的影响：⑴不同浓度葡萄糖对于心脏成纤维细胞增殖的影响:以吸光度值来反应心脏成纤维细胞增殖情况，从MTT结果示:以不同浓度(5.5mmol/L,10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激48小时，随葡萄糖浓度的增加，吸光度值呈剂量依赖性增加，30mmol/L、50mmol/L组与对照组相比， P<0.05有显著统计学差异。30mmo1/L组达峰，50mmol/L组略有降低，但50mmol/L和30mmol/L组两组相比，P>0.05无显著统计学差异。高渗组吸光度值与对照组相比，无显著统计学差异（P>0.05)。⑵不同浓度葡萄糖对于心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达的影响：在不同浓度(5.5mmol/L,10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激下Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达随浓度增加呈剂量依赖性增加，10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L各组较对照组(5.5mmol/L)相比，P<0.01有显著统计学差异，其中50mmol/L组表达最多。高渗组的Ⅰ型前胶原表达与对照组相比，无显著统计学差异(P>0.05)。这些结果提示：高糖引起心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原表达呈浓度依赖性增加，且这一作用与高糖引起的高渗环境无关。⑶不同浓度葡萄糖对于心脏成纤维细胞Visfatin-mRNA/protein表达的影响：在不同浓度(10mmol/L,30mmol/L,50mmol/L)葡萄糖刺激下，各组Visfatin-mRNA/protein表达较对照组(5.5mmol/L)相比均增加，P<0.01有显著统计学差异，其中30mmol/L组表达达峰，浓度50mmol/L组表达Visfatin较30mmol/L组略有减少，但两组间相比，无统计学差异(P>0.05)。高渗组的Visfatin表达与对照组相比，无显著统计学差异(P>0.05)。这些结果提示：在一定浓度范围内，高糖引起心脏成纤维细胞Visfatin表达呈浓度依赖性增加，且这一作用与高糖引起的高渗环境无关。2不同时间的高糖（30mmol/L）刺激对于心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原、Visfatin-mRNA/protein表达的影响：⑴不同时间的高糖（30mmol/L）刺激对于心肌成纤维细胞增殖的影响：以吸光度值来反应心肌成纤维细胞增殖程度，从MTT结果示:30mmol/L葡萄糖不同时间（12、24、48小时）刺激下，各组吸光度值较对照组均显著增加，P<0.05有统计学差异；48小时内随刺激时间的增加，吸光度值呈时间依赖性增加，48小时达峰。⑵不同时间的高糖（30mmol/L）刺激对于心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达的影响：应用30mmol/L葡萄糖不同时间（6、12、24、48小时）刺激下，各组Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达均较对照组显著增加，P<0.01有统计学差异；24小时内随刺激时间的增加，呈时间依赖性增加，24小时达峰，48小时后表达有所降低，与24h组相比无显著统计学差异（P>0.05)。这些结果提示：在一定时间范围内，随高浓度葡萄糖作用时间的延长，心肌成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达呈时间依赖性增加。⑶不同时间的高糖（30mmol/L）刺激对于心肌成纤维细胞Visfatinm-RNA/protein表达的影响：应用30mmol/L葡萄糖不同时间（6、12、24、48小时）刺激下，各组Visfatin-mRNA/protein表达均较对照组增加，其中12、24、48小时组与对照组相比，P<0.01有统计学差异；24小时内随刺激时间的增加，呈时间依赖性增加，24小时达峰，48小时后表达有所降低，与24h组相比无显著统计学差异（P>0.05)。这些结果提示：在一定时间范围内，随高浓度葡萄糖作用时间的延长，心脏成纤维细胞Visfatin的表达呈时间依赖性增加。3Rho/ROCK信号转导通路对高糖（30mmol/L）刺激下心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原、Visfatin-mRNA/protein和ROCK1-protein表达的调节：⑴Rho/ROCK信号转导通路对高糖（30mmol/L）刺激下Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达的调节：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组Ⅰ型前胶原-protein表达增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+Y27632(10μmol/L)组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组Ⅰ型前胶原-protein表达明显降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：Y27632抑制了高糖诱导的心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达。⑵Rho/ROCK信号转导通路对高糖（30mmol/L）刺激下心脏成纤维细胞Visfatin-mRNA/protein表达的调节：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组的Visfatin-protein表达增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+Y27632(10μmol/L)组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，而高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组Visfatin-protein表达明显降低， P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：Y27632抑制了高糖诱导的心肌成纤维细胞Visfatin的表达。⑶Rho/ROCK信号转导通路对心脏成纤维细胞高糖（30mmol/L）刺激下ROCK1-protein表达的调节：与对照组相比，高糖30mmol/L组ROCK1-protein表达增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+Y27632(10μmol/L)组、高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+Y27632(10μmol/L)组ROCK1-protein表达明显降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：Y27632抑制了高糖诱导的心脏成纤维细胞ROCK1的表达。结论：高糖刺激心脏成纤维细胞合成了Visfatin及Ⅰ型胶原，且在一定时间、浓度范围内，呈浓度-时间依赖性表达增加。Rho/ROCK信号转导通路参与介导了高糖环境中心脏成纤维细胞Visfatin及Ⅰ型胶原的合成。第三部分Visfatin对高糖诱导下新生大鼠心脏成纤维细胞胶原合成的影响目的：离体条件下葡萄糖孵育新生SD大鼠心脏成纤维细胞，观察阻断Visfatin的作用后，对乳鼠心脏成纤维细胞合成Ⅰ型胶原和Ⅲ型胶原的影响，从而探讨Visfatin在糖尿病心肌病心肌纤维化中的作用机制。方法：提取、培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞，设对照组（葡萄糖5.5mmol/L）；高糖30mmol/L组；高糖30mmol/L+FK866组；低糖5.5mmol/L组+FK866组。应用Real time-PCR法测定心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原-mRNA表达；Western blot检测Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原蛋白质的表达。结果：1FK866对高糖刺激下心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶-mRNA/protein表达的影响：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+FK866组Ⅰ型前胶原-mRNA表达增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+FK866组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+FK866组Ⅰ型前胶原-mRNA表达明显降低，P<0.05有显著统计学差异。与对照组相比，高糖30mmol/L组Ⅰ型前胶原-protein表达增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+FK866组、高糖30mmol/L+FK866组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+FK866组Ⅰ型前胶原-protein表达明显降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：FK866抑制了高糖刺激下心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达，Visfatin可能参与介导了高糖诱导的心脏成纤维细胞Ⅰ型胶原的合成。2FK866对高糖刺激下心脏成纤维细胞Ⅲ型前胶原-mRNA/protein表达的影响：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+FK866组Ⅲ型前胶原-mRNA/protein表达均增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+FK866组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+FK866组Ⅲ型前胶原-mRNA/protein表达明显降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：FK866抑制了高糖刺激下心脏成纤维细胞Ⅲ型前胶原的表达，Visfatin可能参与介导了高糖诱导的心脏成纤维细胞Ⅲ型胶原的合成。结论：Visfatin参与介导了高糖诱导的心脏成纤维细胞胶原合成及心肌纤维化的过程。第四部分罗格列酮对高糖诱导下新生大鼠心脏成纤维细胞Visfatin及胶原合成的影响目的：离体条件下葡萄糖孵育SD大鼠乳鼠心脏成纤维细胞，观察罗格列酮干预后，对乳鼠心脏成纤维细胞合成Visfatin及Ⅰ型前胶原的影响，从而探讨罗格列酮在糖尿病心肌病心肌纤维化中的作用机制。方法：提取、培养新生SD大鼠心脏成纤维细胞，设对照组（葡萄糖5.5mmol/L）；低糖5.5mmol/L组+罗格列酮组；高糖30mmol/L组；高糖30mmol/L+罗格列酮组。应用Real time-PCR法测定心脏成纤维细胞Visfatin及Ⅰ型前胶原-mRNA表达；Western blot检测Visfatin及Ⅰ型前胶原蛋白质的表达。结果：1罗格列酮对高糖孵育下心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达的影响：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+罗格列酮组Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达均增加，P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+罗格列酮组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+罗格列酮组Ⅰ型前胶原-mRNA/protein表达降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：罗格列酮抑制了高糖诱导的心脏成纤维细胞Ⅰ型前胶原的表达。2罗格列酮对高糖孵育下心脏成纤维细胞Visfatin-mRNA/protein表达的影响：与对照组相比，高糖30mmol/L组、高糖30mmol/L+罗格列酮组Visfatin-mRNA/protein表达均增加， P<0.01有显著统计学差异。低糖5.5mmol/L+罗格列酮组与对照组相比，无统计学差异（P>0.05)。与高糖30mmol/L组相比，高糖30mmol/L+罗格列酮组Visfatin-mRNA/protein均表达降低，P<0.05有显著统计学差异。这些结果提示：罗格列酮抑制了高糖诱导的心脏成纤维细胞Visfatin的表达。结论：罗格列酮抑制了高血糖环境中心脏成纤维细胞Visfatin及胶原的合成，可能在抑制心肌纤维化的过程中发挥了作用。