论文部分内容阅读
研究目的旨在探讨培养、纯化、扩增骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,MMSCs)最佳条件和方法;研究MMSCs在体内的分布,作用时间,作用方式,MMSCs与体内微环境之间的关系及MMSCs促进角膜缘碱烧伤创伤愈合的机理。研究方法本课题分三部分。第一部分采用常规实验室方法观察培养MMSCs;第二部分新西兰大白兔40只(眼),分为两组,每组各20只(20眼)。采取随机双盲。一组为正常对照组,一组为角膜缘碱烧伤组,在移植术后第3、21、60天,检查外周血MMSCs数量变化,在共聚焦显微镜下观察MMSCs全身脏器的分布;第三部分采用角膜缘碱烧伤模型作为实验主体,选择健康无任何眼疾的新西兰大白兔60只(眼),分为两组,每组各30只(30眼)。采取随机双盲。一组为对照组,耳缘静脉注射PBS,作为空白对照;一组为移植组,耳缘静脉移植MMSCs。在移植术后第3、21、60天,用裂隙灯观察角膜新生血管、上皮再生、角膜透明程度;采用普通病理学进行组织病理学检查;应用WesternBlot行TIMP-2检测;免疫荧光染色,在共聚焦显微镜下行移植细胞鉴定、定位和定性检查PCNA、CD44、CD45、MMP-2/TIMP-2、Vimentin、α-SMA、Keratin-pan、CD31抗体表达情况;RT-PCR半定量法检测VEGF、VEGFR、IL-2mRNA表达水平;ELISA检测外周血与房水中VEGF、IL-2的浓度变化;流式细胞学检查外周血中MMSCs数量变化。结果第一部分1.MMSCs的增殖能力在5%～10%的胎牛血清浓度培养基中较高,差异有显著性(P<0.05);骨髓间充质干细胞表达CD90~+、CD29~+、CD44~+、CD34~+、CD106~+、HLA-I,不表达 CD45~-、CD31-、HLA-Ⅱ。其中CD90~+细胞含量在不同培养条件有所不同,随着细胞传代逐渐下降。2.MMSCs随着VEGF、IL-1的浓度增加,迁移率增高,二者呈正相关性(r=0.597;P<0.05),但迁移率随细胞传代次数的增加而下降,6代以后MMSCs迁移率明显降低。第二部分1.移植术后第3、21、60天,外周血中MMSCs的数量在角膜缘碱烧伤组(2.56±0.11;2.98±0.09;1.74±0.07),与正常对照组(0.86±0.05;0.65±0.07;0.54±0.04)相比较,均有显著性差异(P<0.05),且移植MMSCs的起始数量与外周血中MMSCs数量呈正相关(r=0.567;P<0.05)。2.移植术后第3、21、60天,角膜缘碱烧伤组,MMSCs数量由多至少依次为角膜缘、角膜中央、结膜、视网膜、脉络膜、虹膜;在角膜中,上皮层MMSCs较多,内皮细胞层MMSCs较少,在角膜缘MMSCs的分布有"聚集现象"。正常对照组,角膜、结膜、视网膜、脉络膜、虹膜可偶见到MMSCs,数量极少或没有。3.MMSCs移植后在体内分布显示:角膜缘碱烧伤组,移植第3天,MMSCs数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、肌肉、心、脑。第60天,MMSCs数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、心、肌肉、脑;肺脏中MMSCs数量变化有显著性差异(P<0.05);脾脏中MMSCs数量变化没有显著性差异(P>0.05)。正常对照组,移植第3天,在体内MMSCs的分布数量由多至少依次为肺、脾、肾、肝、肌肉、心、脑。移植第60天,数量由多至少依次为脾脏、肺脏、肾脏、肝脏、心肌、肌肉、脑。肺与脾中MMSCs数量变化有显著性差异(P<0.05)。第三部分1.移植组角膜新生血管面积,术后第3、21、60天(12.56±0.46;19.16±0.76;4.36±0.66),与对照组相比(3.34±0.51;14.56±0.46;29.16±0.68),均有显著性差异(P<0.05);角膜混浊程度,术后第3天(2.8±0.2),与对照组(2.9±0.3)相比,无显著性差异(P>0.05);术后第 21、60 天(2.7±0.4;1.9±0.3)与对照组(3.1±0.2;3.5±0.4)相比较,均有显著性差异(P<0.05)。角膜上皮再生程度,术后第3、21、60 天(2.9±.045;2.7±0.39;2.1±0.43),与对照组相比(3.5±0.56;3.8±0.47;3.9±0.51),均有显著性差异(P<0.05)。2.移植组术后3天,外周血清中VEGF(98.23±1.45)、房水中的VEGF(145.12±2.01)浓度高于对照组(10.21±1.23;58.23±1.24),有显著性差异(P<0.05);第 21、60 天,外周血清(56.12±1.56;50.36±1.25)、房水(98.23±1.26;56.12±1.98)中的VEGF浓度低于对照组,有显著性差异(p<0.05);不同观察时间点,移植组IL-2在外周血及房水中的浓度均低于与对照组,有显著性差异(P<0.05)。3.RT-PCR半定量检测VEGF、VEGFR、IL-2mRNA表达水平,术后第3天,移植组角膜组织VEGF、VEGFR高表达,尤以VEGF明显;IL-2在移植组角膜组织中第3、21、60天持续低表达。4.移植组,角膜组织切片可见Dil~+MMSCs-CD31~+、Dil~+MMSCs-TIMP-2~+、Dil~+MMSCs-PCNA~+双阳性细胞存在。CD44 角膜中高荧光表达,CD45表达降低,Vimentin、α-SMA表达增高。Western blot显示角膜组织中高度表达TIMP-2蛋白质。角膜上皮高度表达Keratin-pan,曲线光滑,基底部完整,可见复层上皮细胞。结论1.将全骨髓种植于5%-10%血清培养基中,选择12-48小时贴壁的原代细胞进行消化传代,前4代MMSCss生长的形态、数量、分化能力、增殖力适宜做细胞治疗。MMSCs存在自然分化的生物特性。在体外VEGF、IL-1可增强MMSCs趋化运动能力。2.经全身静脉移植进入体内的MMSCs,脾脏是主要归巢场所。肺脏是外源性MMSCs主要截流场所。在角膜损伤时,MMSCs可定向归巢至角膜损伤处。3.MMSCs移植后早期,在角膜组织中表达了角膜缘干细胞的增殖特性(PCNA),上调了细胞因子VEGF,下调了炎症趋化因子,增加了黏附分子CD44表达,调节金属蛋白酶MMP-2/TIMP-2的平衡关系,从而改变角膜组织创伤愈合的微环境,最终达到了角膜透明性较好(Vimentin、α-SMA晚期表达较低),上皮完整(Keratin-pan高表达),新生血管减轻的治疗目的。4.异体移植MMSCs可抑制角膜缘碱烧伤后免疫系统异常反应。