目的：蛛网膜下腔出血(subarachnoid hemorrhage, SAH)是常见的脑组织出血性病变,因其致死致残率高,且存活者多预后不良,造成患者生活质量下降。研究证实SAH患者脑血管痉挛(cerebralvasospasm, CVS)和早期脑损伤(Early brain injury, EBI)的严重程度,与不良预后相关。因此,非常有必要研制新型药物,控制SAH后早期炎性免疫反应,减轻EBI和CVS的致病性,减轻患者的痛苦。有研究证实,调节性T细胞(CD4+CD25+regulatory T cell, Treg)在抑制脑梗死再灌注小鼠脑组织的损伤方面发挥内源性保护作用。那么,同样做为颅内缺血缺氧性损伤,调节性T细胞能否在SAH后的炎性免疫反应中发挥调节作用呢?我们利用线栓刺破法制作小鼠SAH模型,从小鼠脾、淋巴结中提取并体外扩增调节性T细胞,输入SAH小鼠体内,通过小鼠神经功能学的评价和各项实验数据的分析,探讨Treg对SAH小鼠脑保护作用的疗效。为验证体外细胞实验得到的结论,能否在动物模型中复制,并进一步探讨Treg对体外BV2及体内脑组织保护作用的机制和作用方式,我们通过脂多糖激活BV2活化的体外细胞模型,模拟体内小鼠脑组织SAH缺血缺氧的病理过程,从小鼠脾脏及淋巴结中提取并体外扩增调节性T细胞,与脂多糖激活的BV2共培养,旨在通过Treg与BV2共培养,验证Treg对体外BV2的保护作用机制。我们分别从体外细胞培养和动物在体实验两个角度,从细胞整体水平、蛋白水平和mRNA三个水平共同研究,多方位多角度综合探讨Treg发挥疗效的机制。方法：通过免疫磁珠双选的方法,提取小鼠脾脏及淋巴结Treg。颈内动脉线栓刺破法制作小鼠SAH模型,随机分为Sham组、SAH+PBS组、SAH+SP(Splenocyte,脾细胞)组、SAH+Treg组,经股静脉输注CD4+CD25+Treg,造模成功后48h,记录脑血流量及各组动物行为学指标；分别制备石蜡、冰冻切片,通过不同染色法研究脑细胞形态及阳性细胞的分布情况,验证Treg输注移植对SAH小鼠脑组织的保护作用。脂多糖诱导体外BV2激活,Treg与激活的BV2共培养,采用MTT法检测体外BV2的活性；利用硝酸还原酶法和ELISA法检测炎性因子TNF-α、IL-6、NO、IL-10的含量；采用尼罗红微球吞噬实验,验证Treg对LPS诱导BV2吞噬情况的调节作用。免疫荧光双染及免疫荧光三染法,标记体外BV2和体内SAH小鼠脑组织不同极化状态M1、M2期阳性细胞表达的情况；采用实时荧光定量PCR (RT-PCR)法分别检测体外BV2和SAH小鼠脑组织M 1、M2期标志物mRNA水平的表达量；采用Western blot法分别检测体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织内相关信号通道TLR4/p-NFκB、 p-P38/P-ERK1/2的蛋白表达量。通过多方位多角度的综合研究,深入探讨Treg对BV2和SAH小鼠脑组织保护作用的机制。结果：Treg静脉输注移植,SAH后小鼠死亡率下降,各项生命体征及神经功能学表现情况明显好转,神经功能学评分提高,脑组织血流量改善,小鼠脑水肿情况减轻,脑实质内微动脉及基底动脉痉挛程度减轻,血管内皮细胞受损程度减轻,小鼠脑组织神经元凋亡数量减少,损伤程度降低。Treg与LPS激活的体外BV2共培养,炎性刺激因子含量明显减少,抑制因子IL-10含量增加,同时,BV2在吞噬过程中吞掉了更多的微球,Treg对LPS激活的BV2有明显保护作用。免疫荧光染色显示,Treg输注移植,体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织M1期标记物表达减少,M2期标记物表达上调。RT-PCR结果显示,Treg输注移植,体外小胶质细胞和SAH小鼠脑组织M 1期标记物mRNA水平的表达减少,M2期标志物mRNA水平的表达上调。Western blot结果显示,Treg输注移植,体外BV2和SAH小鼠脑组织内炎性信号通路TLR4、p-NF-κB、p-P38、p-ERK1/勺蛋白表达量明显减少。结论：1、Treg输注移植能够减轻SAH小鼠早期死亡率,改善48h局部脑血流量,有效缓解SAH后血脑屏障的破坏程度,维护脑实质内血管形态的完整性,减轻BA痉挛程度,显著减轻小鼠皮层及海马神经元损伤的程度,减轻脑组织细胞过度凋亡的程度,有助于改善SAH后小鼠神经功能学水平,促进神经元的修复,提高SAH后小鼠生活质量。2、Treg与LPS激活的BV2共培养,细胞培养液炎性刺激因子的含量减少,抑制因子的含量增加,BV2的吞噬作用增强。3、Treg输注治疗可通过减少M1极化状态标记物mRNA水平的表达,抑制小胶质细胞M1极化；增加M2极化状态标记物mRNA水平的表达,促进小胶质细胞M2极化,从而抑制炎性细胞因子的分泌,发挥脑组织的保护功效。4、Treg可能通过抑制炎性信号通路TLR4/p-NF-κB、p-P38/p-ERK1/2的激活,减少炎性刺激因子的表达。本实验创新性地将RT-PCR法和免疫荧光染色法相结合,同时研究Treg对体外BV2和动物体内小胶质细胞不同极化状态的调节作用,通过体外细胞水平的实验与在体动物模型的实验相结合,将动物的行为学观察与细胞分子水平的机制研究相结合,多方面多角度充分地探讨了调节性T细胞对组织。的保护疗效。本实验证明,Treg对体外BV2和SAH小鼠脑组织有明显的保护作用。然而,动物模型水平得出的结论,与临床人体的实际应用仍有较大距离,细胞作为一种生物学活性物质,不能像化学药物一样稳定,其保存及运输等方面存在的问题是临床应用的重要瓶颈。另外,人体活体细胞的移植,尚存在伦理及排异等多方面的问题有待进一步研究和解决。