重组毕赤酵母表达水蛭素的发酵工艺研究

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天然水蛭素是从医用水蛭的唾液腺分泌的一种小分子活性多肽,是目前已知的自然界中最强的抗凝血因子,可有效防治血栓性疾病。由于天然水蛭素原料有限,产量低,成本高,限制了其临床应用,从而采用基因工程技术开发重组水蛭素,可克服以上不足。本文对基因工程菌毕赤酵母表达外源蛋白水蛭素的发酵工艺进行了深入的研究。通过摇瓶培养筛选发酵条件,研究了工程菌的生长特性,通过单因素和正交实验,确定了工程菌的最佳生长和表达条件。在摇瓶研究的基础上,用30 L发酵罐进行了放大培养表达实验。依据工程菌生长状态来变速流加甘油和甲醇的培养方式下,考察了溶氧、温度、pH、外营养物的添加以及改变诱导菌体密度对工程菌生长与表达的影响。结果显示,在整个发酵过程中溶氧控制在30-50 %有利于工程菌的生长和表达;在表达阶段,控制温度为24℃、pH 4.0、添加1 %的酪蛋白水解物,当菌体湿重达到320 g/L后开始诱导,水蛭素的抗凝活力可达到30000 ATU/ml。综合确定了发酵结束时间为诱导后42小时,表达量在28000至31000ATU/ml之间。
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