论文部分内容阅读
【研究背景】弥漫性轴索损伤（Diffuse axonal injury,DAI）,是一种以脑内神经轴索肿胀、断裂弥漫性分布为主要特征的损伤,是创伤性脑损伤（traumatic brain injury,TBI）最常见、最重要的病理特征之一。头部受到机械性外力作用时（如交通事故或摔跌）,快速的水平牵拉力或旋转剪切力作用于脑组织,可致使轴索完全断裂或部分损伤,继而触发分子通路导致继发性轴索断裂或变性。DAI的组织学病变类型表现为收缩球形成及轴索肿胀、增粗、扭曲。这些病变的发生与微管功能障碍和断裂有关,这种断裂导致微管波浪样变和轴浆运输障碍,继而轴浆内运输物质如β-淀粉样前体蛋白（betaamyloid precursor protein,β-APP）发生堆积。DAI的微小的轴索病理改变很难用常规的非侵入性神经影像学检查如电子计算机断层扫描（Computed Tomography,CT）,或磁共振成像（Magnetic Resonance Imaging,MRI）进行明确诊断,这种隐匿的病变给DAI的诊断带来了困难。因此,对DAI后生物标记物的变化及规律研究是目前的研究热点之一,可以据此寻找可靠地脑内或脑外生物标记物来进行诊断、了解疾病发展或评估长期预后。钙衰蛋白（Calsenilin,CSEN）是神经元钙传感器（neuronal calcium sensor,NCS）蛋白家族中的一员,最早发现该蛋白与早老素2（presenilin2,PS2）C端的40个氨基酸结合,并调节PS2蛋白水解产物的水平而命名。CSEN在调节突触可塑性和学习记忆方面发挥作用有关,并且能够调节细胞凋亡及β淀粉样沉淀（amyloid-β,Aβ）形成。前期课题组利用蛋白组学技术筛选DAI大鼠脑组织内差异蛋白,发现CSEN于伤后1h至伤后72h表达均显著上调,提示CSEN在TBI中的重要作用,因此,作为TBI的潜在生物标记物,CSEN在DAI后的轴索损伤中是否具有一定的诊断意义和用于长期预后的推断是否可行,具有重要研究价值。【研究目的】1、研究大鼠DAI后轴索中CSEN的表达规律;2、对CSEN在大鼠DAI后继发性脑损伤中的功能进行初步探究;3、研究大鼠DAI后脑脊液及血浆中CSEN的浓度变化;4、对CSEN作为TBI分子标记物的应用价值进行探讨。【研究方法】1、实验分组分为对照组、假手术组及损伤组,使用成年雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠,参照Marmarou自由落体打击的方法造模,建立大鼠DAI模型。2、使用改良神经功能缺损评分（modified neurological severity scores,m NSS）评估损伤后神经功能状况,剔除损伤较轻的个体。3、收集DAI后0h、6h、1d、2d、3d、7d的大鼠脑组织,通过HE染色评估轴索损伤情况,验证模型可行性;利用Western blot检测大鼠DAI后轴索（脑干及胼胝体）中CSEN表达量的变化,分析轴索内CSEN表达水平变化与DAI损伤程度的关系,探究其在DAI后继发性损伤中的功能。4、收集DAI后6h、1d、3d、7d的大鼠脑脊液和血液,通过ELISA法检测CSEN浓度水平,分析伤后脑脊液及血浆内CSEN浓度水平与脑内表达水平的相关性和临床意义。【研究结果】1、DAI伤后大鼠m NSS评分显示,造模后大鼠大多出现中、重度神经功能损伤,损伤组大鼠伤后即刻与假手术组相比评分显示出明显升高,伤后6h评分出现小幅度下降,伤后1d评分再次升高,达到顶峰。损伤1d后,m NSS评分逐渐回落趋势,伤后第7d评分降至轻度脑损伤水平,未恢复至正常水平。2、DAI实验组大鼠脑HE染色可见,明显脑水肿,散在灶、片状蛛网膜下腔出血,部分皮质神经元体积减小、细胞质深染、核皱缩或溶解,呈缺血缺氧改变;脑干及胼胝体部位可见挫伤灶,伤后6h内仅见轻微水肿未见明显轴索病变,伤后第1～2 d观察到明显轴索肿胀、增粗、扭曲及收缩球形成,伤后第3～7 d病变呈缓解趋势。3、Western blotting检测结果显示,DAI损伤组大鼠脑干中CSEN伤后0h表达量无明显变化,伤后1d表现出明显增强,持续至第3d,伤后第7d表达量仍呈升高趋势;大鼠胼胝体中CSEN伤后6h内表达量无明显变化,伤后1d表现出明显增强,持续至2d,伤后第3d出现下降,伤后7d再次升高。4、ELISA检测结果显示,DAI损伤组大鼠脑脊液CSEN伤后6h浓度显著升高,持续至1d,伤后3d浓度忽然下降,伤后第7d浓度再次显著升高;血浆CSEN伤后6h血浆CSEN浓度即开始升高,并呈持续升高状态,伤后7d仍保持升高趋势。【研究结论】1、轴索内CSEN在伤后高表达,提示其参与继发性轴索损伤修复过程,但这种修复过程可能会产生Aβ的堆积,对DAI后的长期慢性神经退行性疾病产生促进作用;2、DAI后CSEN的表达可以作为生物标记物对损伤后的修复能力进行评估,结合其他能够反映脑损伤后损伤强度的生物学指标,可以对疾病的发展趋势做出合理推断;3、DAI后脑脊液及血浆中CSEN可以较好反映其在轴索中的表达变化,可以用于对脑损伤情况进行评估。4、CSEN作为DAI后长期慢性疾病和退行性疾病的脑外生物标记物具有一定的应用价值。