原发性肝癌是世界第六大常见的恶性肿瘤,我国的肝癌发病率和死亡率居全球之首,因此,对于肝癌治疗的研究显得尤其重要和必要。目前肝癌首选的治疗方案仍是手术切除,但手术切除率低,术后复发率高,化疗常常是可供选择的主要治疗方法和手段,然而,化疗药物大多为细胞毒性药物,对肿瘤和正常组织缺乏靶向性,具有较大的毒副作用。因此,寻求一种有效、安全、靶向性高、毒副作用小的治疗手段迫在眉睫。近年来,超声微泡作为一种药物或基因载体,逐渐受到广泛的关注;载药微泡注入体内后,可以通过血液循环到达靶器官,利用超声可监控微泡到达靶组织的情况,并利用一定强度的超声经体表定位辐照使微泡在靶组织内破裂,从而达到药物定位释放的目的,同时,微泡破裂产生的一系列效应,可增加药物吸收,提高疗效。多西紫杉醇(Docetaxel)是常用的疗效较好的化疗药物之一。由于多西紫杉醇水溶性差,目前市售制剂采用吐温-80增溶、乙醇助溶,易产生溶血及过敏等不良反应,临床使用极为不便;研究表明,将紫杉1烷类药物载入脂质后可明显降低药物的毒性,提高机体耐受性,且能保持与市售注射液相同的抗肿瘤活性。因此,在本实验中,我们将脂质微泡作为一种药物载体,将多西紫杉醇载入了微泡,制备了载多西紫杉醇脂质超声微泡,检测其特性;运用超声靶向微泡破裂使药物定位释放在靶组织,并通过体外和体内实验,探讨载多西紫杉醇微泡联合超声靶向微泡破裂对肝癌的作用及相关机理。本研究为构建一种新的药物剂型提供新策略,载药微泡联合UTMD为肿瘤的靶向治疗提供了新的思路。本课题主要包括以下三部分内容:第一部分载多西紫杉醇脂质微泡的制备及一般特性研究目的制备一种载多西紫杉醇的脂质超声微泡并测定其物理特性。方法采用机械振荡法制备载多西紫杉醇脂质微泡,测定其浓度、粒径分布范围、电位、包封率及载药量等特性;观察60Coγ射线灭菌前后微泡特性的差异及不同储存条件下微泡特性的改变;检测超声辐照后载药微泡内药物的释放。结果载多西紫杉醇微泡的浓度为2.2×109～3.2×109个/ml;粒径分布范围为473.4nm～706.6nm,平均粒径为623.1nm;微泡的包封率高于70%,载药量高于17.5%;Zeta电位为-(3.1±0.9)mV; 60Coγ射线灭菌前后微泡的特性无显著性差异,微泡在4℃、-20℃储存7天后其特性有所改变;超声辐照微泡溶液后,药物可释放。结论本实验成功制备了载多西紫杉醇脂质超声微泡,其包封率较高、粒径均匀、较稳定,超声辐照可使微泡破裂,促使微泡中的药物释放。第二部分载多西紫杉醇脂质微泡联合超声靶向微泡破裂对人SMMC-7721肝癌细胞作用的实验研究目的探索人SMMC-7721肝癌细胞株的体外培养条件及多西紫杉醇体外治疗的适宜浓度。探讨载多西紫杉醇脂质微泡联合超声靶向微泡破裂对SMMC- 7721细胞的增殖抑制、形态学影响、细胞周期的影响、诱导凋亡作用及相关蛋白和基因表达水平的影响。方法体外培养SMMC-7721细胞,观察其生长情况,并用MTT法检测其生长特性,描绘生长曲线。MTT法检测不同浓度多西紫杉醇对SMMC-7721细胞的增殖抑制率,并以此确定适宜的多西紫杉醇体外作用浓度。实验分为6组:空白对照组(C)、单纯药物组(Doc)、载药微泡组(LMLD)、药物+超声组(Doc+US)、单纯微泡+超声组(PLM+US)、载药微泡+超声组(LMLD+US)。MTT法检测不同时间点各组SMMC-7721细胞的增殖抑制率;透射电镜观察其细胞形态和超微结构变化;流式细胞仪检测各组细胞周期分布; Annexin V-FITC荧光染色检测细胞凋亡;实时定量-PCR和Western Blotting法分别检测Caspase3、Bcl-2、Bax在基因和蛋白水平的表达情况。结果在SMMC-7721细胞培养过程中,确定以1×105个/ml细胞数接种。应用一定浓度多西紫杉醇能抑制SMMC-7721细胞生长,呈明显的浓度-时间-效应关系。与其它组比较,LMLD+US组对SMMC-7721细胞的增殖抑制作用最强,细胞凋亡率最高,并可将SMMC-7721细胞明显阻滞在G2/M期。LMLD+US组可见较多凋亡细胞及凋亡小体形成,Doc+US组可见早期凋亡细胞。LMLD+US组Caspase3和Bax在基因和蛋白水平的表达高于其它各组,而Bcl-2在基因和蛋白水平的表达明显低于其它各组。结论多西紫杉醇对SMMC-7721细胞的增殖有抑制作用,确定多西紫杉醇后续实验药物浓度为1×10-9 mol/L。载多西紫杉醇脂质微泡联合超声靶向微泡破裂对SMMC-7721细胞具有明显的增殖抑制作用,并可将细胞明显阻滞在G2/M期、诱导细胞凋亡,其作用机制可能是通过影响细胞凋亡有关的多个基因及蛋白的表达水平。第三部分载多西紫杉醇脂质微泡体内显影观察及其联合超声靶向微泡破裂对兔VX2肝癌的作用目的利用超声检查监测肿瘤情况,并探讨载多西紫杉醇脂质微泡体内的显影效果。研究载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD介导药物靶向释放对兔VX2肝癌的治疗效果。方法90只新西兰大白兔,采用瘤块种植法于肝左叶内植入VX2肿瘤组织块,建立兔肝癌模型。用2D、CDFI及微泡造影观察肿瘤的大小、回声及血流灌注,并和CT检查结果相比较,从而评估超声在兔VX2肝癌模型监测中的应用价值。病理解剖验证VX2瘤株在兔肝脏的成瘤情况。实验动物随机分成6组,每组15只,包括空白对照组(C)、载药微泡组(LMLD)、单纯药物组(Doc)、药物+超声组(Doc+US)、单纯微泡+超声组(PLM+US)、载药微泡+超声组(LMLD+ US)。治疗前后用超声和CT观察肿瘤并测量其大小,计算其体积和肿瘤抑制率;免疫组化法检测肿瘤组织CD34、MMP2及PCNA的表达;TUNEL法检测肿瘤细胞凋亡;原位杂交法检测MMP2和Caspase3 mRNA表达水平;比较各组动物的存活时间和转移情况。结果采用瘤块种植法成功建立了兔肝VX2肝癌模型,成瘤率为100%。超声能较准确地测量肿瘤的大小,能实时、准确地监测肝内肿瘤的回声变化及肿瘤血流情况,超声与CT测量的肿瘤大小无显著性差异(P>0.05);静脉注射载药微泡后,兔肝实质见良好、持续的增强显影,肝癌可见典型的“快进快出”显影表现。LMLD+ US组的肿瘤抑制率明显高于其他各组。治疗后肿瘤内部多呈混合回声,CDFI显示肿瘤的血流明显减少。LMLD+ US组的凋亡指数(AI)显著高于其它各组(P<0.01);LMLD+ US组的肿瘤增殖受到明显抑制,其增殖指数明显低于其它各组(P<0.01);LMLD+ US组MMP2蛋白及mRNA表达水平明显低于其它各组,而Caspase3 mRNA表达明显高于其它各组;LMLD+ US组的动物存活时间明显长于其它组。各组动物均见有腹腔转移,但LMLD+US组的远处转移最少。结论瘤块种植法建立兔VX2肝癌模型操作较简单、成瘤率高。载药微泡对肝实质及肿瘤具有良好的显影效果,超声检查能无创、方便、较准确地监测肝脏VX2肿瘤的大小、形态等;超声检查为利用VX2肝癌模型评价载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD的疗效及实时监控下的治疗提供了有效的监测方法。载多西紫杉醇脂质微泡联合UTMD能抑制兔VX2肝癌的增殖、促进其凋亡,对VX2肝癌具有显著的抗肿瘤作用,为寻求一种有效、安全、靶向性高的肿瘤治疗手段提供了新的思路,为研究一种基于超声微泡的靶向定位控释技术提供了依据。