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目的:HIV/AIDS以发展迅猛、死亡率之高,已成为21世纪人类灾难性的疾病。研究AIDS的发病机制和治疗方法已迫在眉睫。因此本实验研究HIV-1的调节基因Nef对ECV304细胞ICAM-1表达的影响及其信号途径,从而分析HIV-1感染引起内皮细胞ICAM-1高表达的原因,阐明Nef参与HIV-1致病的分子机制,为HIV-1感染的临床治疗提供实验基础。方法:1)PCR方法从HIV-1 HXB2质粒中扩增HIV-1 Nef基因,构建真核表达载体pcDNA 3.1(+)-Nef。2)将pcDNA 3.1(+)-Nef和pcDNA 3.1(+)质粒(阴性对照)分别转染血管内皮细胞ECV304,应用G418筛选,获得稳定表达的细胞株。通过逆转录聚合酶链反应(Reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)、蛋白质印记(Western blot),细胞免疫荧光方法鉴定Nef蛋白的表达。3)应用实时定量PCR( real-time PCR)、Western blot、流式细胞术(Flow cytometry,FCM),细胞黏附试验分析ECV304-Nef细胞ICAM-1的表达水平。4)用Western blot、FCM技术分析信号分子的磷酸化水平与Nef诱导细胞ICAM-1表达的相关性。结果:1)质粒构建成功:构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef经BamHI和EcoRI双酶切鉴定,得到的片段大小与理论值相符,分别为5400 bp和621 bp;测序结果显示的碱基序列与基因Bank (Gene Bank Accession No. K03455)序列相同。2)建立稳定表达细胞株:转染细胞经G418筛选后获得稳定表达Nef的ECV304细胞株:RT-PCR示转染pcDNA 3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞出现621bp条带(Nef mRNA的表达),对照组无目的条带出现;荧光显微镜下观察转染pcDNA 3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞表达的Nef蛋白定位于细胞质中;Western blot结果见转染pcDNA 3.1(+)-Nef质粒的ECV304细胞约27kD处检测到目的条带,表明pcDNA3.1(+)-Nef表达正确。3)Nef表达细胞诱导ICAM-1高表达:RT-PCR、real-time PCR分析显示ECV304-Nef细胞ICAM-1 mRNA表达水平为对照组4.3±0.2倍;细胞黏附实验观察到ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞数明显多于对照组,荧光仪定量分析各孔细胞的荧光强度结果显示: ECV304-Nef细胞黏附的Jurkat细胞的荧光强度值显著高与对照组(P<0.05);Western blot结果示ECV304-Nef细胞ICAM-1蛋白的表达水平高于对照组;流式图显示ECV304-Nef细胞和ECV304 pcDNA 3.1(+)细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为35.3±2.2%和12.5±0.8%(P<0.01),两组间ICAM-1表达有显著差异。4)ERK的磷酸化介导Nef的生物学活性:Western blot结果示与对照组细胞相比,ECV304-Nef细胞ICAM-1与p-ERK的蛋白水平均明显上调。加入p-ERK抑制剂后,ECV304-Nef细胞p-ERK水平被显著抑制,与对照组的p-ERK水平无明显差异,反映抑制剂抑制了Nef上调的p-ERK活性。在同一细胞内检测ICAM-1水平时发现ECV304-Nef细胞的ICAM-1也降至与对照组细胞相当的水平。FCM结果显示加入p-ERK的抑制剂后ECV304-Nef细胞和ECV304 pcDNA 3.1(+)细胞ICAM-1阳性细胞百分率分别为11.4±1.1%和10.4±1.5%(P>0.05),两者没有统计学差异。反映抑制剂也抑制了Nef介导的ICAM-1上调活性,提示Nef介导的ICAM-1上调作用经过了p-ERK的信号分子通路。结论:1)成功地构建了Nef基因的真核表达质粒pcDNA 3.1(+)-Nef。2)成功建立Nef基因在内皮细胞稳定表达的细胞株ECV304-Nef。3)证实了HIV-1 Nef基因可以上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达。4)HIV-1 Nef基因上调血管内皮细胞细胞黏附分子ICAM-1的表达与ERK信号分子磷酸化有关。