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杆状病毒是一类能感染节肢动物的具有囊膜的环状双链DNA病毒,根据宿主的特异性可为4个属:特异性感染鳞翅目的α杆状病毒(Alphabaculovirus)、特异性感染鳞翅目的β杆状病毒(Bctabaculovirus)、特异性感染膜翅目的γ杆状病毒(Gammabaculovirus)和特异性感染双翅目的δ杆状病毒(Deltabaculovirus),其中α、γ、δ为核型多角体病毒(Nucleopolyhedrovirus,NPV),β杆状病毒为颗粒体病毒(Granulovirus,GV).根据保守基因的进化分析,α杆状病毒可以分为group I型NPV和groupⅡ型NPV.AcMNPV(Autographa californica multiplenucleopolyhedrovirus)是杆状病毒中的模式种病毒,具有广泛的宿主范围.AcMNPV的orf114(ac114)是group I型α杆状病毒的一个特有基因,其功能特征还未知.本论文阐述了敲除AcMNPV acll4后对AcMNPV的复制、BV和多角体的生成、病毒粒子的形态发生、对甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)的感染力的影响,并确定了acll4的转录时相及转录起始位点和细胞定位.
首先,利用λ-Red重组系统敲除AcMNPV Bacmid的ac114,再利用Bac-to-Bac系统构建带有gfp和polyhedrin的重组Bacmids.重组Bacmids转染Sf9细胞均能产生BV和多角体.用收获的重组病毒感染Sf9细胞,发现ac114缺失型重组病毒与对照病毒的一步生长曲线趋势一致.取病毒感染的Sf9细胞制备切片进行电镜观察,发现两种病毒均可在细胞核内形成病毒发生基质、核衣壳沿囊膜排列、多角体内包埋有正常形态和大小的病毒粒子,说明缺失ac114对病毒形态发生没有影响.取病毒感染甜菜夜蛾后生成的多角体进行碱裂解,电镜观察多角体内病毒粒子的数目,发现缺失型病毒多角体内病毒粒子的数目显著低于对照病毒.当用重组病毒感染3日龄甜菜夜蛾,发现两种病毒的半数致死时间接近,但缺失型病毒的半数致死剂量却显著增加,说明ac114敲除后对病毒的体外增殖没有明显的影响,但病毒的体内口服感染性显著下降.同时,RT-PCR证明ac114的转录产物在病毒感染细胞后的9 h可以检测到,并持续到感染后72h,说明ac114是一个晚期基因.5-RACE证明ac114的转录起始位点是ATG上游杆状病毒晚期启动子基序TAAG的第一个腺嘌呤A.为了确定Ac114在Sf9细胞的定位,将ac114与gfp基因融合,构建重组病毒,重组病毒感染Sf9)细胞,发现融合蛋白主要定位于细胞质.